乳腺是動物成年后經(jīng)歷增殖、分化、凋亡的唯一器官。奶牛乳腺發(fā)育和泌乳機理的研究對提高奶牛的生產(chǎn)性能及乳品質(zhì)非常重要。microRNAs是一類在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)的短的非編碼RNA。從microRNA的角度研究其對奶牛乳腺發(fā)育和泌乳機理的調(diào)控是一個較新的研究領(lǐng)域。本試驗選取在奶牛分娩前后有差異表達(dá)的bta-miR-145為研究對象，通過生物信息學(xué)分析、文獻(xiàn)報道比較、3’RACE測序、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、RT-qPCR、Western Blotting、雙熒光報告分析等方法在牛乳腺上皮細(xì)胞中初步研究了bta-miR-145的功能。主要研究內(nèi)容如下：1.為了挖掘更多的與bta-miR-145相關(guān)的信息，對bta-miR-145進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。通過MEGA5.05軟件對牛的bta-mir-145進(jìn)行種系發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)牛與人和豬的microRNA145同源關(guān)系較近；通過miR TarBase數(shù)據(jù)對miR-145進(jìn)行已驗證靶標(biāo)收集，發(fā)現(xiàn)在人和小鼠上miR-145靶向IRS1；將Target Scan6.2預(yù)測的bta-miR-145的648個靶標(biāo)帶入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG信號通路分析，發(fā)現(xiàn)大部分靶... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：104 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
表目錄
圖目錄
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 研究目的和意義
    1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.2.1 microRNA 的概述
        1.2.2 與奶牛乳腺發(fā)育和泌乳相關(guān)的 microRNA 的研究進(jìn)展
        1.2.3 bta-miR-145 的研究進(jìn)展
        1.2.4 bta-miR-145 的生物信息學(xué)分析
    1.3 研究內(nèi)容和技術(shù)路線
        1.3.1 研究內(nèi)容
        1.3.2 技術(shù)路線
第二章 牛 IRS1 基因的 3′RACE 測序及結(jié)合位點分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 牛乳腺組織 Total RNA 提取
        2.1.2 已知序列驗證
        2.1.3 3 ′端序列獲取
        2.1.4 RACE 序列驗證
        2.1.5 序列拼接
        2.1.6 對測得的 IRS13’RACE 序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 牛乳腺組織 Total RNA 提取結(jié)果
        2.2.2 已知序列驗證結(jié)果
        2.2.3 3 ′端序列獲取結(jié)果
        2.2.4 RACE 序列驗證結(jié)果
        2.2.5 用 Sequencher 4.9 軟件對上述測得的序列進(jìn)行拼接的結(jié)果
        2.2.6 對測得的 IRS13’RACE 序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析結(jié)果
    2.3 討論
    2.4 結(jié)論
第三章 奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的建立及β-酪蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
    3.1 材料與方法
        3.1.1 主要設(shè)備、試劑、耗材
        3.1.2 培養(yǎng)液
        3.1.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)
        3.1.4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的純化
        3.1.5 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的角蛋白-18 鑒定
        3.1.6 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
        3.1.7 奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長曲線的繪制
        3.1.8 奶牛乳腺上皮細(xì)胞中β-酪蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)
        3.2.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的純化
        3.2.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長曲線
        3.2.4 免疫細(xì)胞熒光染色法鑒定乳腺上皮細(xì)胞角蛋白-18 的表達(dá)
        3.2.5 奶牛乳腺上皮細(xì)胞中β-酪蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果
    3.3 討論
    3.4 結(jié)論
第四章 bta-miR-145 mimic、inhibitor 轉(zhuǎn)染條件的摸索及對細(xì)胞活力的影響
    4.1 材料與方法
        4.1.1 轉(zhuǎn)染前細(xì)胞接種密度的摸索
        4.1.2 轉(zhuǎn)染時 RNAi 與脂質(zhì)體 2000 的最適添加量
        4.1.3 qPCR 檢測轉(zhuǎn)染后 miR-145 過表達(dá)和抑制表達(dá)的效果
        4.1.4 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活力檢測
        4.1.5 miR-145 過表達(dá)和抑制表達(dá)后對的其它幾種 microRNA 基因表達(dá)的影響
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 轉(zhuǎn)染前細(xì)胞接種密度的摸索結(jié)果
        4.2.2 轉(zhuǎn)染時 RNAi 與脂質(zhì)體 2000 的最適添加量及轉(zhuǎn)染效率
        4.2.3 qPCR 檢測牛乳腺上皮細(xì)胞中 miR-145 過表達(dá)和抑制表達(dá)的效果
        4.2.4 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活力檢測結(jié)果
        4.2.5 miR-145 過表達(dá)和抑制表達(dá)對其它幾種 microRNA 的影響
    4.3 討論
    4.4 結(jié)論
第五章 bta-miR-145 靶向 IRS1、CSN2 的 RT-qPCR 驗證及 Western Blot 驗證
    5.1 材料與方法
        5.1.1 細(xì)胞處理和瞬時轉(zhuǎn)染
        5.1.2 樣品 RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量反應(yīng)
        5.1.3 Western Blot 試驗的主要設(shè)備、試劑、耗材
        5.1.4 細(xì)胞蛋白樣品的制備
        5.1.5 SDS-PAGE 電泳
        5.1.6 轉(zhuǎn)膜
        5.1.7 封閉、抗體孵育和顯色
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 過表達(dá)對預(yù)測靶基因 CSN2 和 IRS1 mRNA 表達(dá)的影響
        5.2.2 抑制表達(dá)對預(yù)測靶基因 CSN2 和 IRS1 mRNA 表達(dá)的影響
        5.2.3 BCA 法測定蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
        5.2.4 SDS-PAGE 膠考馬斯亮蘭的染色結(jié)果
        5.2.5 麗春紅染膜的結(jié)果
        5.2.6 轉(zhuǎn)染后牛乳腺上皮細(xì)胞中 IRS1 和 CSN2 蛋白表達(dá)的變化
    5.3 討論
    5.4 結(jié)論
第六章 bta-miR-145 靶向 IRS1、CSN2 的雙熒光報告基因檢測
    6.1 材料與方法
        6.1.1 主要設(shè)備、試劑、耗材
        6.1.2 牛乳腺組織 RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄
        6.1.3 牛重組載體 CSN2-WT 和 IRS1-WT 的構(gòu)建
        6.1.4 雙熒光素酶報告載體分析 miRNA 作用靶點
    6.2 結(jié)果與分析
        6.2.1 基因 3’UTR PCR 擴增結(jié)果
        6.2.2 重組載體菌液 PCR、雙酶切和測序結(jié)果
        6.2.3 雙熒光素酶表達(dá)分析結(jié)果
    6.3 討論
    6.4 結(jié)論
第七章 全文結(jié)論
    7.1 結(jié)論
    7.2 本試驗創(chuàng)新點
    7.3 有待于進(jìn)一步研究的問題
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介



本文編號：3603984