發(fā)布時(shí)間：2022-01-22 17:11

　　大腸桿菌Nissle 1917（EcN）是一種革蘭氏陰性益生菌,因其對(duì)腸道疾病有顯著的緩解效果而被廣泛用于臨床治療中。它能夠通過(guò)其分泌胞外囊泡調(diào)節(jié)宿主腸上皮細(xì)胞的免疫反應(yīng)。巨噬細(xì)胞是固有免疫反應(yīng)中的重要免疫細(xì)胞,然而關(guān)于EcN與巨噬細(xì)胞互作報(bào)道甚少。鑒于此,本試驗(yàn)旨在通過(guò)分離EcN的胞外囊泡（EcN_OMVs）探究其對(duì)巨噬細(xì)胞生物功能的調(diào)節(jié)作用,并利用蛋白組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步挖掘影響巨噬細(xì)胞功能的潛在免疫信號(hào)分子,為EcN在動(dòng)物腸道中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。試驗(yàn)包括兩部分:（1）首先利用差速離心和梯度密度離心法分離和純化EcN_OMVs,用激光納米顆粒分析儀分析其粒徑大小及分布,透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu);利用激光共聚焦顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞對(duì)EcN_OMVs的內(nèi)在化;用玻璃珠涂板法測(cè)定巨噬細(xì)胞吞噬病原性大腸桿菌的數(shù)量以探究EcN_OMVs對(duì)巨噬細(xì)胞殺菌能力的影響。然后分別用PBS（對(duì)照組）、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL和20μg/mL EcN_OMVs刺激RAW264.7... 

【文章來(lái)源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：67 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

EcN的表性特征示意圖(Mohamedetal.,2010)

圖 1-2 OMVs 的形成模型示意圖 (Mashburn-Warren and Whiteley, 2006)Fig 1-2 The biogenesis of OMVs1.3.2 細(xì)菌胞外囊泡負(fù)載的分子胞外囊泡作為一種生物間通訊的載體分子，向胞外分泌時(shí)能夠攜帶 LPS、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和其他毒力因子。在早期的報(bào)道中，通過(guò)生化分析包括聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白免疫印跡技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)胞外囊泡攜帶的外膜蛋白（OmpA、OmpC and OmpF）、周質(zhì)蛋白（堿性磷酸酶和 AcrA）和毒力因子（粘附素、侵襲素和其他酶類）(Lee eal., 2008)。了解這些蛋白質(zhì)的功能，將有助于闡明 OMVs 的形成機(jī)制和生物功能。在過(guò)去的幾年里，基于質(zhì)譜分析的蛋白組學(xué)研究已經(jīng)能夠發(fā)現(xiàn) 3500 多種囊泡蛋白(Kimet al., 2013)。Evpedia 是一個(gè)收列了胞外囊泡相關(guān)性文章和囊泡蛋白高通量數(shù)據(jù)的網(wǎng)站(Kim et al.,2013 )。此網(wǎng)站提供了完整的生物信息分析工具（搜索和瀏覽囊泡成分、基因本體富集分析、囊泡蛋白和 mRNA 的網(wǎng)絡(luò)分析、囊泡數(shù)據(jù)集的同源性鑒定比較），以系統(tǒng)分析真核和原核生物胞外囊泡負(fù)載的分子組成，進(jìn)而闡明這些復(fù)雜細(xì)胞外囊泡的新功能。除了蛋白質(zhì)，胞外囊泡中還存在較豐富的脂質(zhì)。雖然脂類是革蘭氏陰性菌胞外囊

圖 2-1 EcN_OMVs 的分離Fig 2-1 Isolation of EcN_OMVsA：超速離心獲得 OMVs；B：激光納米顆粒分析儀檢測(cè) EcN_OMVs 粒徑分布。A: OMVs precipitation was obtained by ultracentrifugation; B: Size distribution of EcN_OMVsas determined by nanoparticle tracking analysis. EcN_OMVs 的純化獲得高純度的 EcN_OMVs，對(duì)超速離心得到的 OMVs 進(jìn)行密度梯度離心，得到密度層的 OMVs，分別測(cè)定這 11 個(gè)密度層 EcN_OMVs 的濃度和粒徑大�。ū� 2-1）。層的 OMVs 的濃度及粒徑大小存在差異，其中，濃度最高的是第 5 層，為 2.26×/mL，對(duì)應(yīng)的峰值為 115.0 nm。計(jì)算各層 EcN_OMVs 相對(duì)豐度，結(jié)果（圖 2-2示 EcN_OMVs 濃度峰值在 F 5，為了滿足試驗(yàn)需求，選擇 F 4-F 6（濃度梯度在30%）的密度層再次進(jìn)行超速離心富集得到純化的 EcN_OMVs。激光納米顆粒檢測(cè)純化后的 EcN_OMVs 如圖 2-2 B 所示，分布圖線條平滑，且只有一個(gè)峰值，1.5 nm，表明獲得粒徑較均一的高純度 OMVs。表 2-1 密度梯度離心后各層 EcN_OMVs 濃度及粒徑大小ble 2-1 Concentration and size of EcN_OMVs of each layer after density gradient centrifugation

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]細(xì)菌鞭毛運(yùn)動(dòng)、黏附和免疫逃逸機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 許綿,周明旭,朱國(guó)強(qiáng).  中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2017(02)
[2]植物應(yīng)答非生物脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展[J]. 付晨熙,肖自華,高飛,周宜君.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2016(12)
[3]口服益生菌Escherichia coli Nissle 1917調(diào)控?cái)嗄套胸i空腸黏膜屏障功能的機(jī)理研究[J]. 唐志如,鄧歡,孫衛(wèi)忠,張小龍,張翥.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2014(01)



本文編號(hào)：3602585