上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition,EMT）是上皮樣細(xì)胞向間充質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過(guò)程,是一個(gè)中間態(tài)的變化,現(xiàn)已被證明在癌癥發(fā)生、組織愈合以及iPS誘導(dǎo)過(guò)程中起著十分重要的作用。在iPS誘導(dǎo)過(guò)程中,主要發(fā)生的是EMT的逆過(guò)程,即成纖維樣細(xì)胞-上皮樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（MET）,在這一過(guò)程中,會(huì)逐漸失去成纖維的細(xì)胞形態(tài),轉(zhuǎn)變?yōu)檫B接更為緊密的上皮細(xì)胞形態(tài),且能表達(dá)簡(jiǎn)單上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物KRT18、KRT8、KRT19等。KRT18作為中間絲蛋白中的簡(jiǎn)單上皮蛋白,在癌癥和早期胚胎發(fā)育與著床以及iPS誘導(dǎo)過(guò)程MET發(fā)生中起著標(biāo)志性的作用,因此研究這一基因在胚胎發(fā)育與iPS誘導(dǎo)中的作用,對(duì)其在基礎(chǔ)功能上的研究具有重要意義。本研究以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的pKlrkt打靶載體為基礎(chǔ)載體,分別用PCR的方法從胎牛成纖維細(xì)胞基因組中獲得包含有該基因啟動(dòng)區(qū)的5`同源臂和3`同源臂,以酶切連接的方法將兩個(gè)同源臂連在基礎(chǔ)載體的MluI和NheI兩個(gè)位點(diǎn),再對(duì)td-Tomato質(zhì)粒進(jìn)行BamHI和NotI雙酶切,回收片段與連接好兩個(gè)同源臂的pKlrkta載體進(jìn)行連接,獲得內(nèi)含... 

【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：60 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

EMT相關(guān)信號(hào)通路，引自DongreA,WeinbergRA[1]

4.1 pTKlrkt 打靶載體構(gòu)建通過(guò)已經(jīng)設(shè)計(jì)好的引物，以及適宜的PCR條件下，我們獲得了與預(yù)期一致的1240 bp的5`arm，和946 bp的3`arm，如圖1。將這一對(duì)同源臂連到pEASY-T1 Cloning vector上，鑒定并測(cè)序，Blast結(jié)果顯示5`arm和3`arm與GeneBank提供的KRT18序列同源性達(dá)到99%，顯示得到了連接正確的PT-5a和PT-3a兩種質(zhì)粒圖1 同源臂擴(kuò)增結(jié)果 A：5`arm擴(kuò)增結(jié)果；B：3`arm擴(kuò)增結(jié)果（M：1Kb Plus Marker）Figure 1 The amplification results of homology arms A:The PCR results of 5`arm; B: The PCR results of 3`arm（M：1Kb Plus Marker）pTKlrkt打靶載體構(gòu)建完成后，分別用雙酶切或單酶切以鑒定已連接到pTKlrkt打靶載體中的5`arm、3`arm以及td-Tomato片段的大小及方向。鑒定3`arm時(shí)，分別用EcoNI單酶切、BglII和Sfiz雙酶切，電泳后顯示前者酶切片段大小為633bp、4222bp 和5875bp，后者片段大小為1990 bp和5867 bp

連接到pTKlrkt打靶載體中。通過(guò)對(duì)以上三個(gè)外源片段的酶切驗(yàn)證，我們確定pTKlrkt打靶載體連接成功，并使用DNAMAN繪制質(zhì)粒圖譜，如圖3。圖23`arm 、5`arm和td-Tomato酶切鑒定結(jié)果 A、B：3`arm鑒定結(jié)果；C：5`arm鑒定結(jié)果；D：td-Tomat鑒定結(jié)果（M：1Kb Plus Marker）Figure 2 The restriction enzyme digestion results of 3`arm、5`arm and td-Tomato A、B：Identification resultsof 3`arm; C：The results of 5`arm tests; D：Identification result of td-Tomato (M：1Kb Plus Marker)


本文編號(hào)：3583384