牛病毒性腹瀉病毒（bovineviraldiarrheaviruses，BVDV）是牛病毒性腹瀉-粘膜病的主要抗原，該病在世界各國都有比較普遍的發(fā)生和存在。該病對我國養(yǎng)殖業(yè)同樣構(gòu)成嚴(yán)重危脅。因此，國內(nèi)、外對BVD的防治都非常關(guān)注。但是目前針對BVDV感染尚無特異性的預(yù)防疫苗、治療方法和抗病毒藥物。因此建立新的抗病毒方法，控制病毒的擴(kuò)散具有重要意義。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行抗病育種已成為研究熱點(diǎn)，而抗病候選基因的克隆和驗(yàn)證是轉(zhuǎn)基因新品種培育中急待解決的關(guān)鍵問題。本研究從兩個角度開展抗BVDV功能基因研究：（1）靶向病毒基因設(shè)計(jì)siRNA，抑制BVDV增殖為目的，將RNAi技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)行抗病毒功能基因研究，并在綿羊個體進(jìn)行抗BVDV效果評價，為制備抗BVDV轉(zhuǎn)基因家畜動物奠定基礎(chǔ)；（2）以修飾宿主抗BVDV功能基因，提高BVDV易感動物的抗病性能為目的，通過microRNAs（miRNAs）的差異表達(dá)分析，篩選宿主抗BVDV功能基因，為我國抗病轉(zhuǎn)基因新品種培育和產(chǎn)業(yè)化提供基因資源。首先，設(shè)計(jì)靶向BVD病毒Npro、C、NS3、NS4B、NS5A基因的shRNA干擾片段，構(gòu)建相應(yīng)的s... 

【文章來源】：石河子大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：157 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
目錄
主要縮略詞
引言
第一章 文獻(xiàn)綜述
    綜述一 牛病毒性腹瀉病毒的研究進(jìn)展
        1、BVDV概況
        2、BVDV基因組結(jié)構(gòu)及功能
        3、BVDV的持續(xù)感染
    綜述二 轉(zhuǎn)基因動物的研究進(jìn)展
        1、轉(zhuǎn)基因動物制作方法
        2、轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用前景
        3、轉(zhuǎn)基因動物研究中存在的問題
    綜述三 RNA干擾及其在抗病毒中的應(yīng)用
        1、RNAI分子機(jī)制
        2、RNAI與MIRNA
        3、RNAI與抗病毒研究
第二章 實(shí)驗(yàn)研究
    實(shí)驗(yàn)一 高效抑制BVDV復(fù)制SHRNA干擾片段的設(shè)計(jì)及篩選
        摘要
        1 材料
            1.1 病毒和細(xì)胞
            1.2 載體和菌株
            1.3 限制性內(nèi)切酶、工具酶及試劑盒
        2 方法
            2.1 靶向BVDVshRNA片段的設(shè)計(jì)及合成
            2.2 靶向BVDVshRNA干擾載體的構(gòu)建
            2.3 shRNA干擾載體轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞
            2.4 細(xì)胞攻毒
            2.5 熒光定量PCR檢測BVDVmRNA的表達(dá)
            2.6 病毒TCID50檢測
        3 結(jié)果
            3.1 靶向BVDVshRNA干擾載體的構(gòu)建
            3.2 shRNA干擾載體對病毒接種后細(xì)胞病變情況的影響
            3.3 熒光定量PCR檢測shRNA干擾載體的抗病毒效果
            3.4 TCID50檢測shRNA干擾載體的抗病毒效果
        4 討論
            4.1 RNAi片段的選擇
            4.2 雙干擾片段的設(shè)計(jì)
            4.3 細(xì)胞水平抗BVDV效果評價
        5 小結(jié)
    實(shí)驗(yàn)二 抗BVDV轉(zhuǎn)基因陽性綿羊胎兒成纖維細(xì)胞的制備
        摘要
        1 材料
            1.1 菌種及質(zhì)粒
            1.2 限制性內(nèi)切酶和工具酶
        2 方法
            2.1 轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2 綿羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離
            2.3 靶向BVDV轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pNeo-2loxp-u6-shBVDV線性化
            2.4 G-418綿羊胎兒成纖維細(xì)胞最佳篩選濃度的測定
            2.5 線性化的pNeo-2loxp-u6-shBVDV轉(zhuǎn)染綿羊胚胎成纖維細(xì)胞
            2.6 細(xì)胞的篩選
            2.7 陽性細(xì)胞的鑒定
        3 結(jié)果
            3.1 轉(zhuǎn)基因載體pNeo-2loxp-u6-shBVDV鑒定
            3.2 綿羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)
            3.3 轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的獲得
            3.4 陽性細(xì)胞抗病毒效果分析
        4 討論
            4.1 綿羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)
            4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定篩選
            4.3 轉(zhuǎn)基因綿羊胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定
            4.4 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對BVDV復(fù)制的抑制作用
        5 小結(jié)
    實(shí)驗(yàn)三 抗BVDV轉(zhuǎn)基因綿羊抗病毒效果評價
        摘要
        1 材料
            1.1 實(shí)驗(yàn)動物
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 體細(xì)胞核移植
            2.2 胚胎移植
            2.3 妊娠診斷
            2.4 轉(zhuǎn)基因綿羊外源基因整合鑒定
            2.5 shRNA在轉(zhuǎn)基因綿羊中的表達(dá)分析
            2.6 細(xì)胞水平抗BVDV能力檢測
        3 結(jié)果
            3.1 綿羊卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)
            3.2 重構(gòu)胚胎的體外發(fā)育
            3.3 靶向抑制BVDV復(fù)制轉(zhuǎn)基因綿羊的研究
            3.4 轉(zhuǎn)基因綿羊PCR鑒定
            3.5 shRNA在轉(zhuǎn)基因綿羊中的表達(dá)分析
            3.6 流產(chǎn)胎兒成纖維細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及細(xì)胞水平抗BVDV能力檢測
        4 討論
            4.1 shRNA轉(zhuǎn)基因綿羊的制備
            4.2 轉(zhuǎn)基因動物流產(chǎn)及克隆效率低
            4.3 轉(zhuǎn)基因綿羊體細(xì)胞抗BVDV感染能力的初步評價
        5 小結(jié)
    實(shí)驗(yàn)四 MIR-1249在MDBK細(xì)胞中的抗BVDV研究
        摘要
        1 材料
            1.1 細(xì)胞、病毒
            1.2 主要試劑
        2 方法
            2.1 總體技術(shù)路線
            2.2 測序樣品準(zhǔn)備
            2.3 高通量測序
            2.4 凋亡相關(guān)microRNA預(yù)測及分析
            2.5 microrRNA的驗(yàn)證
            2.6 miR-1249功能分析(凋亡檢測)
            2.7 miR-1249靶點(diǎn)驗(yàn)證
        3 結(jié)果
            3.1 建立病毒感染miRNA表達(dá)譜
            3.2 差異表達(dá)miRNAs篩選及鑒定
            3.3 miR-1249表達(dá)驗(yàn)證
            3.4 miR-1249功能研究
            3.5 miR-1249靶基因研究
        4 討論
            4.1 miR-1249功能研究
            4.2 miR-1249作用靶點(diǎn)分析
            4.3 Bcl-2蛋白表達(dá)量分析
            4.4 miR-1249靶基因調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制
            4.5 抗BVDV轉(zhuǎn)基因綿羊抗病育種新思路
        5 小結(jié)
第三章 全文結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)
    全文結(jié)論
    創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
附錄
    附件（一） 實(shí)驗(yàn)一技術(shù)路線
    附件（二） 實(shí)驗(yàn)二技術(shù)路線
    附件（三） 實(shí)驗(yàn)三技術(shù)路線
    附件（四） 實(shí)驗(yàn)四技術(shù)路線
致謝
個人簡歷
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本文編號：3565289