旨在獲得豬CCAR1基因的完整CDS序列,研究其亞細(xì)胞定位和表達(dá)特性,探究其對(duì)細(xì)胞增殖的影響和作用機(jī)制。本研究以1日齡馬身豬腎組織cDNA為模板,采用RT-PCR技術(shù)分段擴(kuò)增豬CCAR1基因的CDS區(qū),通過(guò)測(cè)序和序列拼接獲得完整CDS區(qū);采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)CCAR1在PK15細(xì)胞中的定位;采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)豬CCAR1基因的時(shí)空表達(dá)規(guī)律;采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除PK15細(xì)胞的CCAR1基因,通過(guò)qRT-PCR、Western blot以及CCK8（cell counting kit 8）技術(shù)檢測(cè)CCAR1基因敲除對(duì)細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明,豬CCAR1基因的完整CDS區(qū)長(zhǎng)3 459 bp（MH301308.1）,在PK15細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)。大白豬和馬身豬不同組織CCAR1的表達(dá)譜基本相似,在所檢測(cè)的組織中均有表達(dá),均表現(xiàn)為在腎和小腸中表達(dá)量最高,在脾、肝、小腦和肌肉中呈中度表達(dá),在心和皮下脂肪中低表達(dá);CCAR1基因在大白豬和馬身豬初生、3月齡和6月齡3個(gè)年齡階段的兩種骨骼肌中也均有表達(dá)。CRISPR/Cas... 

【文章來(lái)源】：畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,51(11)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：14 頁(yè)

【部分圖文】：

RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)預(yù)測(cè),CCAR1蛋白包括5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,分別為S1-Like結(jié)構(gòu)域、SPOR super結(jié)構(gòu)域、DBC1結(jié)構(gòu)域、SAP結(jié)構(gòu)域以及SMC_N super結(jié)構(gòu)域(圖2);跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白不屬于跨膜蛋白(圖3);磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,CCAR1蛋白存在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸共3個(gè)磷酸化位點(diǎn),發(fā)生在3個(gè) 位置上磷酸化修飾的氨基酸殘基數(shù)分別為36、30和6(圖4);亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,73.9%定位于細(xì)胞核,13.0%定位于細(xì)胞骨架,8.7%定位于線粒體,4.3%定位于細(xì)胞質(zhì)膜(圖5)。圖3 CCAR1跨膜預(yù)測(cè)結(jié)果

為確定CCAR1在細(xì)胞中的表達(dá)定位,本研究采用免疫熒光技術(shù)在PK15細(xì)胞系中檢測(cè)其亞細(xì)胞定位,結(jié)果表明,CCAR1蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)(圖6)。圖5 CCAR1亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]凋亡相關(guān)因子CCAR1、Par-4在胃腺癌中的表達(dá)及臨床意義[J]. 呂蓉蓉,齊潔敏,陳龍.  承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào). 2018(06)
[2]Wnt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控[J]. 張寧芳,高鵬飛,成志敏,樂(lè)寶玉,郭曉紅,李步高,曹果清.  生命科學(xué). 2018(05)
[3]利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建CREB基因敲除細(xì)胞系并探討CREB對(duì)APP基因表達(dá)的調(diào)控作用[J]. 郭姍姍,張冰瑩,何文欣,石曉光,劉昆梅,孫濤,崔建奇.  中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào). 2017(09)
[4]CARP-1（Cell Division Cycle and Apoptosis Regulator Protein 1）的生物功能和表達(dá)模式探究[J]. 賈寶林.  生物化工. 2016(02)

博士論文
[1]CCAR-1通過(guò)調(diào)節(jié)unc-52/perlecan的RNA選擇性剪接影響半橋粒結(jié)構(gòu)[D]. 傅容.蘇州大學(xué) 2017

碩士論文
[1]CCAR-1在中國(guó)鹵蟲(chóng)胚胎滯育解除過(guò)程中的作用[D]. 賈寶林.遼寧師范大學(xué) 2016



本文編號(hào)：3553202