本文關(guān)鍵詞：犬狂犬病病毒抗體液態(tài)芯片檢測方法研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：狂犬病是由親神經(jīng)性狂犬病病毒引起的一種高度致死性人獸共患病,幾乎可以感染所有的溫血脊椎動物,病死率約為100%。對于寵物犬和普通實(shí)驗(yàn)犬而言,需定期檢測血清中狂犬病病毒抗體水平,從而進(jìn)行感染監(jiān)測和免疫效果評價(jià),而無特定病原體實(shí)驗(yàn)犬狂犬病病毒抗體要求必須為陰性。目前,常規(guī)的檢測狂犬病血清抗體水平的方法均無法實(shí)現(xiàn)狂犬病與其他犬常見病毒性傳染病的同時(shí)檢測。液態(tài)芯片是一種新型的高通量檢測技術(shù),可以對同一樣品中多種不同生物分子進(jìn)行檢測,與多種病原體或抗體分別檢測相比,不僅節(jié)省了很多時(shí)間,而且大大提高了樣品的利用率。本研究通過狂犬病病毒糖蛋白的表達(dá)和B細(xì)胞線性抗原表位預(yù)測及合成兩種途徑制備狂犬病病毒糖蛋白人工抗原�？袢〔《咎堑鞍谆蚬こ炭乖闹苽洳捎美ハx桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng):利用RT-PCR方法擴(kuò)增糖蛋白基因,亞克隆至p MD18-T載體,經(jīng)PCR和測序鑒定后,成功構(gòu)建了重組克隆質(zhì)粒p MD18T-SRV9G;將SRV9G基因再次克隆到p Fast Bac Dual質(zhì)粒上,經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定后,成功構(gòu)建了重組供體質(zhì)粒p Fast Bac Dual-SRV9G;重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,挑取白色克隆進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果表明成功構(gòu)建了重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-SRV9G;鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,觀察細(xì)胞病變,收獲并擴(kuò)增重組桿狀病毒,并對其進(jìn)行負(fù)染電鏡觀察,結(jié)果表明重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染成功;通過SDS-PAGE和Western blot檢測重組桿狀病毒的表達(dá),結(jié)果顯示Sf9細(xì)胞成功表達(dá)了狂犬病病毒糖蛋白�？袢〔《咎堑鞍卓乖砦活A(yù)測:通過對糖蛋白的基本性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)分析,結(jié)合DNAStar、在線分析工具Bepipred和ABCpred預(yù)測得到8段可能性較大的B細(xì)胞線性抗原表位,篩選部分序列后合成,用于液態(tài)芯片方法的建立。本研究將狂犬病病毒糖蛋白及其B細(xì)胞線性抗原表位TG16-1、TG16-2、GS-12、DG-14分別偶聯(lián)到磁性羧基微球上制備捕獲微球,檢測相同的陰性和陽性血清進(jìn)行評價(jià)。初步篩選出用于液態(tài)芯片檢測的抗原為狂犬病病毒糖蛋白和表位多肽TG16-1。將表位多肽TG16-1分別偶聯(lián)到磁性熒光微球和聚苯乙烯熒光微球制備捕獲微球,檢測相同的血清,結(jié)果發(fā)現(xiàn)聚苯乙烯熒光微球效果比磁性熒光微球效果好。以巰基聚苯乙烯微球?yàn)檩d體,分別偶聯(lián)狂犬病病毒糖蛋白和表位多肽TG16-1,制備了兩種不同的捕獲微球。對檢測過程中兩種不同的捕獲微球用量、PE標(biāo)記羊抗犬Ig G濃度、血清孵育時(shí)間及PE標(biāo)記羊抗犬Ig G孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果為:狂犬病病毒糖蛋白和表位多肽TG16-1的捕獲微球用量均為1μL,PE標(biāo)記羊抗犬Ig G反應(yīng)濃度分別為8μg/m L和4μg/m L,血清孵育時(shí)間分別為2 h和1 h,PE標(biāo)記羊抗犬Ig G孵育時(shí)間分別為1h和0.5 h。因表位多肽易合成,純度高,利于成果轉(zhuǎn)化,最終確定檢測抗原為表位多肽TG16-1。對犬狂犬病病毒抗體液態(tài)芯片檢測方法進(jìn)行特異性和敏感性評價(jià),犬狂犬病病毒抗體液態(tài)芯片與犬瘟熱、犬細(xì)小、犬傳染性肝炎陽性血清均無交叉反應(yīng);抗體效價(jià)最低檢測限為0.41 IU/m L。本研究成功建立了犬狂犬病病毒抗體液態(tài)芯片檢測方法,該方法特異性強(qiáng),敏感性高,為犬主要病毒性傳染病高通量快速檢測試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：狂犬病病毒糖蛋白 桿狀病毒表達(dá) B細(xì)胞線性抗原表位預(yù)測 液態(tài)芯片
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文縮寫詞表11-12
• 引言12-13
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述13-28
• 第1章 重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展13-22
• 1 原核表達(dá)系統(tǒng)13-14
• 2 酵母表達(dá)系統(tǒng)14-16
• 3 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)16-18
• 4 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)18-20
• 5 無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)20-22
• 第2章 狂犬病的診斷與監(jiān)測技術(shù)22-28
• 1 直接快速免疫組化試驗(yàn)22-23
• 2 快速免疫層析試驗(yàn)23
• 3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR23-24
• 4 系統(tǒng)發(fā)生生物地理學(xué)分析24-25
• 5 蛋白質(zhì)組學(xué)分析25-26
• 6 液態(tài)芯片檢測技術(shù)26-28
• 第二篇 研究內(nèi)容28-71
• 第1章 狂犬病病毒糖蛋白人工抗原的制備28-57
• 1.1 材料28-31
• 1.2 方法31-43
• 1.3 結(jié)果43-53
• 1.4 討論53-55
• 1.5 小結(jié)55-57
• 第2章 狂犬病病毒抗體液態(tài)芯片檢測方法的建立57-71
• 2.1 材料58-59
• 2.2 方法59-63
• 2.3 結(jié)果63-68
• 2.4 討論68-70
• 2.5 小結(jié)70-71
• 結(jié)論71-72
• 參考文獻(xiàn)72-83
• 導(dǎo)師簡介83-84
• 作者簡介84-85
• 致謝85-86

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：354781