豬鏈球菌（Streptococcus suis, SS）是豬的重要病原菌,可引起豬的腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎及急性死亡。SS2的毒力最強(qiáng),流行最廣。為進(jìn)一步了解SS致病機(jī)制,深入探討了小RNA（sRNA）rssO4與rss05對(duì)SS2腦膜炎分離株P(guān)1/7的影響。應(yīng)用比較基因組學(xué)方法,揭示SS2腦膜炎分離株SC070731特有一個(gè)105K基因島及新的毒力相關(guān)基因。1. sRNA rssO4和rss05對(duì)SS2腦膜炎分離株P(guān)1/7毒力的影響本課題組前期對(duì)P1/7轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)29個(gè)sRNAs,為探究sRNA對(duì)SS毒力的影響,挑選出分別在豬腦脊液中上調(diào)表達(dá)的sRNA rssO4和在豬血液中上調(diào)表達(dá)的sRNA rssO5深入研究。利用溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pSET4s定點(diǎn)敲除P1/7的rss04和rss05基因,成功構(gòu)建缺失株△rssO4和△rssO5,以及互補(bǔ)株C-rssO4和C-rssO5.斑馬魚毒力試驗(yàn)顯示,兩個(gè)缺失株毒力顯著低于野毒株和相應(yīng)互補(bǔ)株；豬全血存活試驗(yàn)表明,與野生株相比,缺失株△rssO5在豬全血中的存活能力顯著降低（*P<0.05）,而△rssO4與野生株目比差異不顯著；H... 

【文章來源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖３－１無痕缺失原理圖??Ｆｉｇ．?３－１?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｓｔｒａｔｅｇｙ?ｏｆ?ｇｅｎｅ?ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ?ｂｙ?ａｌｌｅ＂ｃ?Ｋｐｌａｃｅｍｅｎｔ??

ｆｅ．ｗ?；．．巧．■?聽圓??圖３－３Ａ?ｐＳＥＴ４ｓ：ＴＭ０４雙酶切鑒定?圖３－３Ｂ?ｐＳＥＴ４ｓ：：ｒｓｓ０５雙酶切鑒定??Ｆｉｇ．?３－３Ａ?Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ?Ｆｉｇ．?３－３Ｂ?Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ??ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??１：?ｐＳＥＴ４ｓ：：阿Ｓ０４用戶Ｗ?Ｉ和防ｏＲ?Ｉ雙酶切?１：?ｐＳＥＴ４ｓ：：＂ｊ０４用戶Ｗ?Ｉ和抗加Ｉ雙酶切??Ｍ：?ＤＬ５０００?ｍａｒｋｅｒ?Ｍ：?ＤＬ５０００?ｍａｒｋｅｒ??３．３基因缺失株篩選及鑒定??巧引物Ｒｓｓ０４ＣＵ／Ｄ和Ｒｓｓ０５ＣＵ／Ｄ對(duì)無Ｓｐｃ抗性的候選缺失株進(jìn)行ＰＣＲ鑒定（圖３－４Ａ??和３－４Ｂ），初步篩選目的菌株。用引物ＲＳＳ０４ＣＵ／Ｄ擴(kuò)增野毒株片段大小應(yīng)為７９卿３，而??缺失株Ａｒｓｓ０４擴(kuò)增出的片段大小應(yīng)為２８０ｂｐ；用引物ＲＳＳ０５ＣＵ／Ｄ擴(kuò)增野毒株片段大小應(yīng)??為６８０ｂｐ，而缺失株Ａｒｓｓ０５擴(kuò)增出的片段大小應(yīng)為３９６ｂｐ。ＰＣＲ產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電??泳顯示出的結(jié)果相符。并且分別用引物ＲＳＳ０４－Ａ／Ｄ和ＲＳＳ０５－Ａ／Ｄ擴(kuò)增出的４ＡＤ和５?ＡＤ片??段送到公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增的基因組片段中不含有缺失的目的基因，并且兩??端同源臂中的基因無突變，缺失株Ａｒｓｓ０４和Ａｒｓｓ０５構(gòu)建成功。缺失株Ａｒｓｓ０４和Ａｒｓｓ０５在??ＴＨＢ液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳１０代

?和互補(bǔ)株，缺失株Ａｒｓｓ０４?（Ｐ?＜?０．０１）的毒力比Ａｒｓｓ０５?（Ｐ?＜?０．０５）減弱得更加明顯；??而互補(bǔ)株Ｃ－ｒｓｓ０４和Ｃ－ｒｓｓＭ的毒力與野生株相當(dāng)（圖３－７）。??３．７全血存活試驗(yàn)??分別將野毒株Ｐ１／７、缺失株與新鮮無茵的豬全血作用４ｈ。Ｗ化的ＣＦＵ作為１００％，??４ｈ后的ＣＦＵ與之相比較，計(jì)算存活率。Ｗ?Ｐ１／７的存活率為１００％，將各缺失株與之??相比較（圖３－８Ａ），缺失株Ａｒｓｓ０５在豬全血中的存活能力下降了約３０％，變化明顯；??而Ａｒｓｓ０４的存活能力沒有明顯變化。??在相同條件下，野生株、缺失株與ＴＨＢ相互作用的結(jié)果分析（圖３－８Ｂ）表明，??缺失株的生長率相對(duì)于野毒株，并沒有明顯差異。從而說明缺失株在豬全血中表型的??變化，并不是由于生長缺陷造成的。??Ａ?Ｂ??Ｓｕｒｖｉｖａｌ?ｉｎ?ｐｉｇ?ｂｌｏｏｄ?Ｇｒｏｗｔｈ?ｉｎ?ＴＨＢ??ｆｃ?１－５＊１?３〇ｉ??％?２５－?一?Ｔ．??１?１－０－?ＨＩ?２０－?ｉｌｌ?ｆｌ?：??圓廣１?１５．?■?＼??｝。．５．｜．．．?ｉ?．１??一＿ｉｐＬ?ｏ－ＵＵｍ—Ｌ?，??

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