本研究通過qRT-PCR技術(shù)檢測成年綿羊和羔羊卵丘細胞內(nèi)組織蛋白酶（CTSB、CTSS）基因表達規(guī)律，Tunel染色并結(jié)合流式細胞儀檢測卵丘細胞凋亡，研究成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度組織蛋白酶特異性抑制劑E-64對卵丘細胞凋亡及卵母細胞發(fā)育能力的影響。探究CTSB、CTSS基因表達、綿羊卵丘細胞凋亡與卵母細胞發(fā)育能力相關(guān)性，以期探索提高綿羊卵母細胞成熟及發(fā)育潛能的新途徑。研究結(jié)果如下：成年綿羊與羔羊卵母細胞體外成熟液中添加不同濃度的E-6（40μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L），分別于體外成熟（IVM）的0h、8h、16h、24h檢測組織蛋白酶基因表達量，結(jié)果表明：成年綿羊及羔羊卵丘細胞內(nèi)CTSB、CTSS基因表達量在體外成熟過程中，隨時間的延長而逐漸下降；E-64添加組卵丘細胞內(nèi)CTSB、CTSS基因表達量均在不同程度上低于對照組，其中5μmol/L和10μmol/L組于IVM8h、16h、24h基因表達量與對照組相比，被顯著下調(diào)（p<0.05），5μmol/L和10μmol/L組間差異不顯著（P>0.05）。卵母細胞體外成熟液中添加不同濃度E-... 

【文章來源】：河北農(nóng)業(yè)大學河北省

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

哺乳動物的卵泡發(fā)育階段（改自Edson等，2009）

）對研究細胞凋亡的指導性作用。很多實驗研究也證明了組織蛋白酶與細。Smith Basil[32]等研究發(fā)現(xiàn) camalexin（一種植物抗毒素，模式植物擬南芥過改變組織蛋白酶（cathepsin)D 的表達及活動減少前列腺癌細胞生存能力有抗增殖和防御癌癥的效果，推測其可以作為治療前列腺癌的新藥劑。還 D 通過激活 caspase-8 誘導中性粒細胞凋亡, 減輕炎癥反應(yīng)[33]。Gao C[34]等e（一種特定的組織蛋白酶 B 抑制劑）做預處理，可非常明顯但不是全部組織蛋白酶 B 的活性與細胞凋亡呈正相關(guān)的關(guān)系。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與生發(fā)現(xiàn)在腫瘤當中加入 cathepsins 能夠增強腫瘤藥物的敏感性，加速腫瘤細

細胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段：接受凋亡信號→凋亡調(diào)控分子間的相互作用→解酶的活化（Caspase）→進入連續(xù)反應(yīng)過程。盡管凋亡過程的詳細機制尚不完全清楚，但在細胞凋亡的啟動階段還是凋亡執(zhí)行階段，Caspase 家族即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中都非常關(guān)鍵的作用，是多細胞動物體內(nèi)所有凋亡蛋白中最主要、最核心的死亡執(zhí)行者[56-58]。細胞凋亡過程實際是 Caspase 不可逆水解有限水解底物的級聯(lián)放大反應(yīng)過程。 Caspas有很多種類，如 caspase2、3、6、7、8、9、10，它們的分子有很高的同源性，結(jié)構(gòu)相似，活性位點均包含半胱氨酸殘基，能夠特異性的切割靶蛋白天冬氨酸殘基上的肽鍵。這些 ca家族成員在細胞生長的不同階段選擇性地切割某些蛋白質(zhì)，使細胞正常的生命活動無法進而造成細胞凋亡。圖 1-3（引自[59]）為線粒體內(nèi)外凋亡通路，細胞表面死亡受體和細胞內(nèi)線介導半胱天冬酶（caspase）級聯(lián)反應(yīng)，最終導致死亡的執(zhí)行。而組織蛋白酶又在各個級聯(lián)程中起到調(diào)控作用，如：組織蛋白酶 B（CTSB）在特定的環(huán)境下酶切 Bid（一種僅含有 B構(gòu)域的 Bcl-2 家族蛋白）產(chǎn)生活性片段，進而增大線粒體外膜通透性，促進線粒體中細胞色釋放及 caspase 活化，最終激活介導細胞凋亡的“溶酶體-線粒體途徑”， 組織蛋白酶 C（CT組織蛋白酶 D（CTSD）、組織蛋白酶 L（CTSL）等多種組織蛋白酶也在細胞凋亡過程中用[60-65]。因此組織蛋白酶在細胞內(nèi)的表達規(guī)律及與細胞凋亡的相關(guān)性研究是非常必要的，律的揭示將為細胞凋亡與存活調(diào)控機制的探究提供更多的參考價值。凋亡相關(guān)基因及蛋白的發(fā)掘與生產(chǎn)也將為凋亡相關(guān)疾病的預防、治療指引方向。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Ghrelin參與FSH對牛卵丘細胞體外增殖的調(diào)節(jié)[J]. 米焱,張伶俐,李海軍,杜晨光,曹貴方,王秀梅.  畜牧獸醫(yī)學報. 2013(08)
[2]鴨肉中組織蛋白酶B的特性研究[J]. 陸應(yīng)林,徐幸蓮,周光宏.  畜牧與獸醫(yī). 2012(10)
[3]組織蛋白酶對成年綿羊卵母細胞體外發(fā)育能力的影響[J]. 劉志濤,田樹軍,孫樹春,陳曉勇,張艷普,胡媛媛,郭軍艾.  畜牧獸醫(yī)學報. 2011(12)
[4]溶酶體與細胞凋亡[J]. 趙凱,衛(wèi)濤濤.  生命科學. 2011(11)
[5]保留卵丘細胞對短時受精結(jié)果的影響[J]. 金海霞,孫瑩璞,辛志敏,宋文妍,戴善軍.  實用醫(yī)學雜志. 2011(21)
[6]細胞凋亡檢測方法的研究進展[J]. 佟俊杰,張廣耘,袁曉.  口腔醫(yī)學. 2010(07)
[7]白毒鵝膏菌毒素誘導小鼠肝細胞凋亡的DNA凝膠電泳分析[J]. 李春豐,江清林,莊樹文,薛勇.  科技信息. 2010(11)
[8]溶酶體組織蛋白酶參與細胞凋亡過程的分子機制[J]. 李志剛,張智博.  中國腫瘤生物治療雜志. 2009(06)
[9]NF-κB與cox-2在胃癌細胞增殖與凋亡的研究進展[J]. 宿連政,靳祥云.  科技信息. 2009(29)
[10]水牛卵丘顆粒細胞凋亡與卵母細胞體外發(fā)育潛能的研究[J]. 王曉麗,楊娟,陳玉,成俊萍,潘紅平,韋精衛(wèi),陸鳳花,石德順.  畜牧獸醫(yī)學報. 2009(09)

碩士論文
[1]綿羊CTSB基因克隆及其活性與卵母細胞發(fā)育能力相關(guān)性研究[D]. 祁昕.河北農(nóng)業(yè)大學 2013
[2]綿羊卵丘細胞中組織蛋白酶基因表達及其對卵母細胞發(fā)育能力影響[D]. 劉志濤.河北農(nóng)業(yè)大學 2011



本文編號：3543069