豬流行性腹瀉是一種由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的急性腸道傳染病,主要引起一周齡內(nèi)新生仔豬呈水樣腹瀉,伴隨有嘔吐,萎靡,食欲減退,常引發(fā)嚴(yán)重脫水而死亡,對(duì)畜牧業(yè)造成極大的損失。小腸的炎癥反應(yīng)是PEDV感染引起仔豬腹瀉、脫水的主要原因,該反應(yīng)主要通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子發(fā)揮作用。而NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控既包括蛋白水平的信號(hào)分子表達(dá)量和翻譯后修飾調(diào)控,也包括轉(zhuǎn)錄水平的mi RNA、lnc RNA等的表達(dá)和作用,但lnc RNA是否參與PEDV感染過(guò)程中炎癥的調(diào)控尚未得知。本研究利用二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),分析PEDV感染豬小腸以及Vero細(xì)胞樣品中l(wèi)nc RNA的表達(dá)水平,重點(diǎn)篩選與NF-κB通路相關(guān)并差異表達(dá)的lnc RNA,熒光定量PCR驗(yàn)證其表達(dá)規(guī)律,構(gòu)建lnc RNA過(guò)表達(dá)載體,在Vero細(xì)胞中進(jìn)行真核表達(dá),分析過(guò)表達(dá)lnc RNA后PEDV復(fù)制水平的變化,初步分析lnc RNA在PEDV感染過(guò)程的影響機(jī)制,為豬流行性腹瀉的致病機(jī)理研究提供一定基礎(chǔ)。1、PEDV感染豬小腸樣品以及Vero細(xì)胞樣品的轉(zhuǎn)錄組分析本研究通過(guò)PEDV-YJH分別感染豬小腸組織以及Vero... 

【文章來(lái)源】：浙江農(nóng)林大學(xué)浙江省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

不同胰酶濃度及病毒接種量下Vero細(xì)胞各時(shí)間段的CPE情況

PEDV感染細(xì)胞和豬小腸組織的轉(zhuǎn)錄組分析23virusinoculationTrypsinconcentration：A.2.5μg/mL；B.2.5μg/mL；C.5μg/mL；D.5μg/mLVirusinoculation：A.0.6MOI；B.1.2MOI；C.0.6MOI；D.1.2MOI2.2PEDV-YJH細(xì)胞感染試驗(yàn)及免疫組化結(jié)果實(shí)驗(yàn)所用PEDV毒株來(lái)源于浙江內(nèi)規(guī)�；B(yǎng)殖場(chǎng)的臨床腹瀉樣本，通過(guò)Vero細(xì)胞，分離出PEDV-YJH毒株，病毒傳代條件為：病毒維持液是高糖DMEM中加入胰酶（不含EDTA）的濃度為5μg/mL；PEDV接種量為1.2MOI。傳代至90代次后，測(cè)得病毒滴度為107TCID50/0.1mL。病毒接種Vero細(xì)胞后，20h開(kāi)始出現(xiàn)少量CPE，48h出現(xiàn)大面積CPE，72h細(xì)胞基本全部裂解。如圖所示，生長(zhǎng)曲線顯示PEDV-YJH在36h-72h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，免疫組化結(jié)果可看出小腸上皮細(xì)胞出現(xiàn)大面積凋亡情況。圖2PEDV分離及生物學(xué)特征鑒定A.PEDV-YJH感染Vero細(xì)胞的CPE變化；B.PEDV-YJH的生長(zhǎng)曲線；C.PEDV感染仔豬后腸道上皮細(xì)胞的組織病理變化。Figure2IsolationofPEDVandidentificationofbiologicalcharacteristicsA.CPEchangesofVerocellsinfectedwithPEDV-YJH;B.GrowthcurvesofPEDV-YJH;C.HistopathologicalchangesofintestinalepithelialcellsafterpigletsinfectedwithPEDV.2.3PEDV-YJH感染豬小腸組織LncRNA的表達(dá)譜分析PEDV-YJH（1×10-7TCID50/頭）口服感染仔豬后，收集小腸樣品進(jìn)行二代轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序。通過(guò)測(cè)序結(jié)果構(gòu)建了mRNA差異表達(dá)譜和LncRNA差異表達(dá)譜，其中mRNA表達(dá)譜中有167條基因上調(diào)以及169條基因下調(diào)，LncRNA表達(dá)譜中則相對(duì)較少,共含有47條上調(diào)LncRNA和62條下調(diào)LncRNA。在差異表達(dá)的

PEDV感染細(xì)胞和豬小腸組織的轉(zhuǎn)錄組分析24lncRNA中選擇9組與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)聯(lián)的，以這些lncRNA的靶向基因命名，分別為1.LncRNAMOCR1；2.LncRNAPKCE；3.LncRNACNOT1；4.LncRNAIFN-OMEGA；5.LncRNACDC42BPA；6.LncRNASUDS3；7.LncRNAPSMA5；8.LncRNAIL7；9.LncRNACACNA1E。括號(hào)中為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中與之相靶向的mRNA。使用預(yù)先設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。RT-PCR結(jié)果表明LncRNASUDS3與對(duì)照相比表達(dá)水平顯著提高。圖3仔豬小腸樣品lncRNA差異表達(dá)譜A.PEDV感染仔豬后腸道組織LncRNA表達(dá)熱點(diǎn)圖；B.LncRNA的靶基因信號(hào)通路KEGG富集；C.病毒感染后mRNA以及LncRNA表達(dá)差異統(tǒng)計(jì)；D.熒光定量PCR驗(yàn)證LncRNA表達(dá)差異結(jié)果Figure3DifferentialexpressionoflncRNAinpigletsmallintestinesamplesA.HotspotsofLncRNAexpressioninintestinaltissuesafterPEDVinfectioninpiglets;B.KEGGenrichmentofLncRNAtargetgenesignalingpathway;C.StatisticsofmRNAandLncRNAexpressiondifferencesafterviralinfection;D.ResultsofLncRNAexpressiondifferencesverifiedbyfluorescencequantitativePCR2.4PEDV-YJH感染Vero細(xì)胞lncRNA表達(dá)差異分析用Vero細(xì)胞進(jìn)行鋪板，分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組都設(shè)置0h、24h、48h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置三個(gè)重復(fù)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。我們發(fā)現(xiàn)不同時(shí)

【參考文獻(xiàn)】：
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