產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）又稱魏氏梭菌（C.welchii）,呈桿狀,革蘭陽性菌,廣泛存在于自然界中,是一種危害性較強(qiáng)的人畜共患病病原體,主要引起人和多種動(dòng)物的食物中毒,創(chuàng)傷性壞疽或氣性壞疽,分泌性、壞死性或者出血性腸炎,腸毒血癥,痢疾等。該病具有發(fā)病急、病程短、死亡率高的特點(diǎn),經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物的急性死亡,對(duì)人類健康及養(yǎng)殖業(yè)具有較大的威脅。產(chǎn)氣莢膜梭菌本身并無侵襲力,致病性主要由其分泌外毒素作用所致。根據(jù)4種主要毒素α（CPA）、β（CPB）、ε（Etx）、iota（Cpi）的產(chǎn)生情況將產(chǎn)氣莢膜梭菌劃分為A、B、C、D、E 5種毒素型。由于產(chǎn)氣莢膜梭菌所致的疾病具有發(fā)病急、病程短的特點(diǎn),往往不能及時(shí)發(fā)現(xiàn),導(dǎo)致常規(guī)藥物很難得到理想效果,疫苗是最主要的預(yù)防手段。當(dāng)前廣泛使用的疫苗主要為多聯(lián)苗。這些疫苗主要成分為滅活菌體或者是類毒素或者是將其混合組成,其具有一些缺點(diǎn)如抗原成分復(fù)雜,有效抗原成分少,易引起免疫副反應(yīng),重組疫苗可能是一個(gè)解決方案。已有研究證明表達(dá)產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素C末端CPA^247-370能夠賦予小鼠高的保護(hù)率;具有H106... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

產(chǎn)氣莢膜梭菌Cp-abx抗原決定簇軟件分析

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文323.2大腸桿菌表達(dá)載體PET28a-abx的構(gòu)建用PCR擴(kuò)增產(chǎn)氣莢膜梭菌Cp-abx融合基因片段，并用核酸電泳檢測(cè)，照膠儀中顯示出與預(yù)期大小的目的條帶（如圖2A所示），目的條帶大小為1941bp，之后，膠回收Cp-abx融合蛋白的PCR產(chǎn)物，送往青島睿博興科生物科技有限公司測(cè)序。鑒定結(jié)果正確后連接克隆載體質(zhì)粒pEASY-Blunt3，進(jìn)行雙酶切與測(cè)序驗(yàn)證，雙酶切后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)后出現(xiàn)了特異性目的條帶（如圖2B所示），測(cè)序結(jié)果顯示，目的片段成功連接在克隆載體上。將雙酶切片段，與相同內(nèi)切酶酶切后的表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)4℃過夜連接。同樣用酶切、測(cè)序兩種方法進(jìn)行驗(yàn)證（如圖2C所示）。連接大腸桿菌重組表達(dá)載體pET-28a(+)，同樣和空載體分別用熱激法轉(zhuǎn)入BL21（DE3）。用氨芐抗性篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，測(cè)序鑒定結(jié)果準(zhǔn)確。結(jié)果表明：重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-Cp-abx成功轉(zhuǎn)化到了BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。圖2產(chǎn)氣莢膜梭菌Cp-abx大腸桿菌重組質(zhì)粒PCR鑒定圖Fig.2PCRamplificationofrecombinantplasmidofClostridiumperfringensCp-abx注：(A)PCR擴(kuò)增Cp-abx電泳圖;(B)連接Blunt3載體酶切鑒定圖;(C)pET-28a(+)-Cp-abx重組表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定圖Note:(A)PCRamplificationofCp-abx;(B)DigestionofrecombinantplasmidBlunt3-Cp-abxbyXhoⅠ和NcoⅠ;(C)DigestionofrecombinantplasmidpET-28a(+)-Cp-abxbyXhoIandNcoI

產(chǎn)氣莢膜梭菌α-β-ε毒素融合蛋白的表達(dá)及其免疫原性分析333.3Cp-abx融合蛋白在大腸桿菌原核表達(dá)、鑒定及純化培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，圖3A為誘導(dǎo)表達(dá)不同時(shí)間蛋白表達(dá)量�？梢燥@示重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Cp-abx轉(zhuǎn)化BL21（DE3）誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物可以出現(xiàn)大小約為71.15kDa的特異性條帶，和預(yù)期表達(dá)蛋白大小相符。目的蛋白經(jīng)純化后，經(jīng)SDS-PAGE分析，可見凝膠中只剩一條大小約為71.15kDa的條帶。為了進(jìn)一步鑒定蛋白表達(dá)的正確與否，用WesternBlot技術(shù)對(duì)目標(biāo)蛋白的HIS標(biāo)簽、ETXH106P進(jìn)行特異性驗(yàn)證，一抗分別為鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體、鼠抗ETXH106P蛋白多克隆抗體；二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，DAB顯色試劑盒顯色后�？梢娪�71.15kDa大小的條帶（如圖3B、C所示），與上述SDS-PAGE蛋白條帶結(jié)果相吻合。因此，在本試驗(yàn)中，Cp-abx融合蛋白，在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中被成功表達(dá)，且特異性良好。圖3(A)重組蛋白的SDS-PAGE(B)抗HISWesternblot分析(C)抗ETXH106PWesternblot分析Fig.3SDS-PAGE、WesternblottingoftheCp-abxprotein.注：(A)不同誘導(dǎo)時(shí)間下的SDS-PAGE鑒定圖，M：蛋白Marker；1為陰性對(duì)照，2-7依次為表達(dá)1h、2h、3h、4h、5h、6h的產(chǎn)物。(B)不同誘導(dǎo)時(shí)間下的Westernblotting鑒定圖（抗HIS標(biāo)簽）。M：蛋白Marker；1為陰性對(duì)照，2-7依次為表達(dá)1h、2h-6h的產(chǎn)物。(C)Westernblotting鑒定圖。M：蛋白Marker；1：陰性對(duì)照；2：抗ETXH106P。Note：(A)SDS–PAGEidentificationatdifferentinductiontimes.M:proteinmarker;lane1,negativecontrol.lanes2-7,transformedwithrecombinantplasmidsafter1,2,3,4,5and6hofIPTGinduction;(B)Westernblottingidentification.M:proteinmarker;lane1,negativecontrol.;lane2-7:transf

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]A、C、D型牛產(chǎn)氣莢膜梭菌三價(jià)類毒素疫苗的初步研制及免疫效果評(píng)價(jià)[D]. 劉增祿.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 2018
[2]灰葡萄孢蛋白激發(fā)子BcSpl1誘導(dǎo)番茄抗病機(jī)制研究[D]. 張易.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2015
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本文編號(hào)：3499012