腸毒素大腸桿菌K88（ETEC K88）是一種常見的腸道微生物,也是引起仔豬腹瀉和死亡的主要致病微生物。養(yǎng)殖業(yè)中準確、低成本、簡便、快速地找出引起仔豬腹瀉的原因及微生物的種類甚至是血清型一直是一個難以攻克的難題,一些很好的生物產品如疫苗、卵黃抗體等也因此在仔豬疾病預防和治療中的不能大規(guī)模低成本應用。建立和完善針對于ETEC K88的低成本、簡便、快速分析檢測體系并實現(xiàn)在養(yǎng)殖業(yè)中的商業(yè)化應用是降低這一類致病微生物引起的仔豬死亡的重要手段。本文以ETEC K88為目標模式菌,利用生物學方法篩選和制備以K88菌毛蛋白為靶標的單克隆抗體和適配體、以ETEC K88菌體為靶標的細胞適配體和適配體文庫,鑒定了它們與靶標的結合性能,初步構建了基于這幾種生物探針的檢測體系分別用于K88菌毛蛋白和ETEC K88菌體的快速檢測分析。同時,成功建立了一個新的FluMag-Cell-SELEX （FluMag Cell systematic evolution of ligands by exponential enrichment）細胞適配體篩選方法。實驗結果如下：本文優(yōu)化了ETEC K88的發(fā)酵工藝,在... 

【文章來源】：湖南師范大學湖南省 211工程院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 引言與文獻綜述
    1.1 腸毒素大腸桿菌ETEC K88
        1.1.1 大腸桿菌
        1.1.2 腸毒素大腸桿菌(ETEC)
        1.1.3 ETEC菌毛
        1.1.4 ETEC K88和K88菌毛
    1.2 大腸桿菌引起的仔豬腹瀉
        1.2.1 仔豬黃痢
        1.2.2 仔豬白痢
        1.2.3 斷奶仔豬腹瀉
    1.3 大腸桿菌的檢測方法
        1.3.1 標準檢測方法和血清型鑒定
        1.3.2 新型快速檢測方法
    1.4 用于大腸桿菌檢測的生物探針
        1.4.1 核酸(DNA)探針
        1.4.2 抗體探針
        1.4.3 適配體探針
    1.5 適配體
        1.5.1 適配體與靶目標的結合
        1.5.2 適配體的篩選(SELEX技術)
        1.5.3 適配體作為探針與抗體的比較優(yōu)勢
    1.6 本課題研究的工作思路和主要內容
第二章 K88菌毛蛋白的提取純化和單克隆抗體的制備
    2.1 實驗儀器與材料
        2.1.1 主要儀器
        2.1.2 菌種和培養(yǎng)基
        2.1.3 實驗動物及細胞
        2.1.4 主要試劑配制
        2.1.5 其他試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 ETEC K88菌毛蛋白的制備
        2.2.2 ETEC K88菌毛蛋白的單克隆抗體制備
        2.2.3 K88菌毛蛋白單克隆抗體生物素標記及Western Blot鑒定
        2.2.4 K88菌毛蛋白單克隆抗體親和力測定
        2.2.5 K88菌毛蛋白單克隆抗體效價測定
        2.2.6 K88菌毛蛋白單克隆抗體與ETEC K88的結合性能分析
        2.2.7 K88菌毛蛋白單克隆抗體與ETEC K88的結合特異性分析
        2.2.8 基于K88菌毛蛋白單克隆抗體的ABS-ELISA體系對K88菌毛蛋白的檢測靈敏度分析
    2.3 實驗結果與討論
        2.3.1 ETEC K88菌毛蛋白的制備
        2.3.2 ETEC K88菌毛蛋白單克隆抗體的篩選和制備
        2.3.3 K88菌毛蛋白單克隆抗體效價測定
        2.3.4 K88菌毛蛋白單克隆抗體的親和力測定
        2.3.5 K88菌毛蛋白單克隆抗體與ETEC K88的結合性能分析
        2.3.6 K88菌毛蛋白單克隆抗體與ETEC K88的結合特異性分析
        2.3.7 基于K88菌毛蛋白單克隆抗體的ABS-ELISA體系檢測ETECK88菌毛蛋白的靈敏度分析
    2.4 討論和小結
第三章 EIECK88菌毛蛋白適配體的篩選、鑒定及利用Aptamer-ABS-ELISA方法快速分析ETEC K88菌毛蛋白
    3.1 實驗儀器與材料
        3.1.1 主要儀器
        3.1.2 菌種和培養(yǎng)基
        3.1.3 主要試劑配制
        3.1.4 其他試劑
        3.1.5 隨機SSDNA文庫的構建以及引物合成
        3.1.6 適配體的合成和修飾
    3.2 實驗方法
        3.2.1 細菌的準備和稀釋平板菌落計數(shù)(MPN)
        3.2.2 ETEC K88菌毛蛋白的制備
        3.2.3 SELEX過程
        3.2.4 膠回收純化ssDNA文庫
        3.2.5 富集文庫與K88菌毛蛋白的結合率分析
        3.2.6 測序
        3.2.7 克隆序列分析及二級結構預測
        3.2.8 K88菌毛蛋白適配體親和力測定
        3.2.9 K88菌毛蛋白適配體和ETEC K88的結合性能分析
        3.2.10 K88菌毛蛋白適配體與ETEC K88的結合特異性分析
        3.2.11 基于適配體的Aptamer-ABS-ELISA法檢測ETEC K88菌毛蛋白體系檢測ETEC K88的靈敏度分析
    3.3 實驗結果
        3.3.1 富集文庫與K88菌毛蛋白的結合率分析
        3.3.2 克隆序列一級結構序列同源性分析
        3.3.3 候選適配體二級結構預測
        3.3.4 候選K88菌毛蛋白適配體與ETEC K88的結合性能分析
        3.3.5 K88菌毛蛋白適配體親和力測定
        3.3.6 K88菌毛蛋白適配體和ETEC K88的結合性能分析
        3.3.7 K88菌毛蛋白適配體與ETEC K88的結合特異性分析
        3.3.8 基于K88菌毛蛋白適配體的APTAMER-ABS-ELISA法檢測ETEC K88菌毛蛋白體系的靈敏度分析
    3.4 討論和小結
第四章 不同CELL-SELEX技術篩選ETEC K88細胞適配體
    4.1 實驗儀器與材料
        4.1.1 主要儀器
        4.1.2 菌種和培養(yǎng)基
        4.1.3 主要試劑配制
        4.1.4 其他試劑
        4.1.5 隨機SSDNA文庫的構建以及引物合成
        4.1.6 適配體的合成和修飾
    4.2 實驗方法
        4.2.1 細菌的準備和稀釋平板菌落計數(shù)(MPN)
        4.2.2 經(jīng)典CELL-SELEX過程(離心分離法)
        4.2.3 熒光磁珠法CELL-SELEX(FLUMAG-CELL-SELEX)過程
        4.2.4 SSDNA文庫的膠回收和純化
        4.2.5 反篩(COUNTER-SELEX)
        4.2.6 富集文庫與K88菌毛蛋白的結合率分析
        4.2.7 測序
        4.2.8 克隆序列分析及二級結構預測
        4.2.9 K88免疫磁珠(K88 IMB)的可靠性研究
    4.3 實驗結果
        4.3.1 K88 IMB的可靠性研究
        4.3.2 經(jīng)典SELEX技術篩選ETEC K88細胞適配體
        4.3.3 FLUMAG-CELL-SELEX技術篩選ETEC K88細胞適配體
        4.3.4 兩種SELEX技術篩選ETEC K88細胞適配體對比
    4.4 討論和小結
第五章 基于細胞適配體/細胞適配體文庫直接熒光探針分析與免疫磁分離技術相結合快速檢測ETEC K88研究
    5.1 實驗儀器與材料
        5.1.1 主要儀器
        5.1.2 菌種和培養(yǎng)基
        5.1.3 主要試劑配制
        5.1.4 其他試劑
        5.1.5 適配體的合成和修飾
    5.2 實驗方法
        5.2.1 細菌的準備和稀釋平板菌落計數(shù)(MPN)
        5.2.2 FITC修飾的適配體文庫的擴增
        5.2.3 ETEC K88細胞適配體親和力測定
        5.2.4 ETEC K88細胞適配體和細胞適配體文庫(Aptamer library)與ETEC K88的結合性能分析
        5.2.5 基于細胞適配體/適配體文庫的直接熒光分析法-IMS技術相結合快速分析檢測ETEC K88
    5.3 實驗結果
        5.3.1 ETEC K88細胞適配體親和力測定
        5.3.2 ETEC K88細胞適配體和細胞適配體文庫與ETEC K88的結合性能分析
        5.3.3 基于細胞適配體/適配體文庫的直接熒光探針分析-IMS技術相結合快速分析檢測ETEC K88
    5.4 討論和小結
第六章 結論和展望
    6.1 結論
    6.2 展望
參考文獻
攻讀博士學位期間撰寫、發(fā)表的學術論文
致謝



本文編號：3488723