禽β-防御素（AvBDs）是一類廣泛存在于禽體內(nèi)的內(nèi)源性陽離子抗菌肽,主要特征結(jié)構(gòu)是含有6個半胱氨酸殘基構(gòu)成的3對二硫鍵�？咕氖菣C(jī)體防御微生物入侵體內(nèi)的第一道屏障。具有廣譜抗菌、抗病毒、抗真菌的生物學(xué)作用,在禽類的先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。本研究運(yùn)用基因克隆的方法,分別從鴿的骨髓、法氏囊、骨髓和肝臟組織中擴(kuò)增到4個新的鴿p-防御素基因。將推導(dǎo)的氨基酸序列與相關(guān)的p-防御素的氨基酸序列同源性比較分析,將其分別命名為鴿β-防御素1（AvBD1）、鴿β-防御素2（AvBD2）、鴿β-防御素7（AvBD7）和鴿β-防御素10（AvBD10）。將得到的序列與已發(fā)現(xiàn)的相關(guān)的禽防御素及部分哺乳動物序列分析表明：鴿p-防御素1編碼區(qū)包含198個核苷酸,編碼65個氨基酸殘基,與鴨β-防御素1氨基酸同源性最高為81.54%；鴿β-防御素2編碼區(qū)包含195個核苷酸,編碼64個氨基酸殘基,與火雞p-防御素2氨基酸同源性最高為85.94%；鴿p-防御素7編碼區(qū)包含204個核苷酸,編碼67個氨基酸殘基,與雞、鴨p-防御素7氨基酸同源性最高為64.71%；鴿p-防御素10編碼區(qū)包含204個核苷酸,編碼67個氨... 

【文章來源】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 抗菌肽簡介
    1.2 防御素的研究進(jìn)展
        1.2.1 防御素的定義
        1.2.2 防御素的結(jié)構(gòu)特征與分類
        1.2.3 防御素的應(yīng)用
    1.3 禽AvBDs的研究進(jìn)展
        1.3.1 禽AvBDs的結(jié)構(gòu)特征
        1.3.2 禽AvBDs重組蛋白的制備
        1.3.3 禽AvBDs的生物學(xué)特性
        1.3.4 禽AvBDs的組織分布
        1.3.5 禽AvBDs的誘導(dǎo)表達(dá)
    1.4 Toll樣受體的研究進(jìn)展
    1.5 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株及質(zhì)粒載體
        2.1.2 藥品、試劑及配制
        2.1.3 主要儀器
    2.2 鴿β-防御素基因的克隆與序列分析
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)用動物及組織樣品的采集
        2.2.2 組織總RNA的提取
        2.2.3 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)
        2.2.4 RT-PCR產(chǎn)物的回收
        2.2.5 PCR產(chǎn)物的連接
        2.2.6 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.2.8 堿裂解法質(zhì)粒的提取
        2.2.9 重組質(zhì)粒的PCR鑒定與測序
        2.2.10 基因序列分析及同源性比較
    2.3 重組鴿β-防御素蛋白的原核表達(dá)
        2.3.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.2 重組鴿β-防御素蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.3.3 重組鴿β-防御素蛋白的純化
    2.4 重組鴿β-防御素蛋白的抗菌活性測定
    2.5 不同NaCl濃度對鴿β-防御素重組蛋白抗菌活性影響
    2.6 重組鴿β-防御素蛋白的溶血試驗(yàn)
    2.7 重組鴿β-防御素蛋白體外抗病毒活性的測定
        2.7.1 毒株及實(shí)驗(yàn)動物
        2.7.2 雞胚接種實(shí)驗(yàn)
        2.7.3 病毒TCID50測定
    2.8 檢測鴿β-防御素及TLRs經(jīng)新城疫病毒誘導(dǎo)后的組織表達(dá)差異
        2.8.1 實(shí)驗(yàn)用動物及組織樣品的采集
        2.8.2 熒光定量引物的設(shè)計(jì)
        2.8.3 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備
        2.8.4 樣品組織cDNA的制備
        2.8.5 鴿AvBDs及TLRs基因的檢測
    2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 鴿β-防御素基因的克隆
    3.2 重組質(zhì)粒的鑒定
    3.3 測序結(jié)果及分析
    3.4 鴿β-防御素基因的遺傳進(jìn)化分析
    3.5 重組鴿β-防御素蛋白的原核表達(dá)
        3.5.1 表達(dá)用重組表達(dá)質(zhì)粒pMD18-T-Pigeon AvBDs鑒定
        3.5.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pProEX-pigeon AvBDs的鑒定
        3.5.3 重組鴿β-防御素蛋白的原核表達(dá)與純化
    3.6 重組鴿β-防御素及His標(biāo)簽蛋白的抗菌活性
    3.7 不同NaCl濃度對鴿β-防御素重組蛋白抗菌活性的影響
    3.8 重組鴿β-防御素蛋白的溶血試驗(yàn)
    3.9 重組鴿β-防御素蛋白的抗病毒活性
    3.10 經(jīng)新城疫病毒誘導(dǎo)后,鴿β-防御素及TLRs在鴿組織器官中表達(dá)差異
4 討論
    4.1 鴿β-防御素基因克隆與遺傳進(jìn)化分析
    4.2 重組鴿β-防御素融合蛋白的原核表達(dá)
    4.3 重組鴿β-防御素蛋白的生物學(xué)特性
        4.3.1 重組鴿AvBDs及His標(biāo)簽蛋白的抗菌活性
        4.3.2 不同NaCl濃度對鴿AvBDs重組蛋白抗菌活性的影響
        4.3.3 重組鴿β-防御素蛋白的溶血活性
        4.3.4 重組鴿β-防御素蛋白抗病毒活性
    4.4 鴿β-防御素及TLRs經(jīng)新城疫誘導(dǎo)后的組織表達(dá)差異
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]鴿β-防御素5基因克隆及其抗菌活性[J]. 辛勝男,張可心,張名岳,韓宗璽,邵昱昊,劉曉麗,劉勝旺,馬得瑩.  生物工程學(xué)報(bào). 2012(11)
[2]NDV感染的雞胚成纖維細(xì)胞TLR7 mRNA表達(dá)的動態(tài)變化[J]. 孟巍,劉新雷,王杲強(qiáng),李廣興,張瑞莉,鄭世民.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2012(06)
[3]Toll樣受體的研究進(jìn)展[J]. 何曉霞,白海.  西北國防醫(yī)學(xué)雜志. 2010(06)
[4]Toll樣受體與疾病[J]. 沈二霞.  分子診斷與治療雜志. 2009(04)
[5]維生素D3對絲毛烏骨雞組織中β-防御素基因的表達(dá)調(diào)控[J]. 李思明,周定剛.  動物營養(yǎng)學(xué)報(bào). 2009(04)
[6]雞β-防御素-3在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及其生物活性測定[J]. 趙緒永,馬輝,趙麗,朱禮倩,李清州.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2009(01)
[7]TLR4-NF-κB在防御素調(diào)節(jié)獲得性免疫中的作用[J]. 楊玉榮,佘銳萍,梁宏德.  免疫學(xué)雜志. 2008(01)
[8]Toll樣受體3與自身免疫性疾病[J]. 楊再興,仲人前.  現(xiàn)代免疫學(xué). 2006(06)
[9]豬β防御素1基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)[J]. 姜麗華,盧海蓉,黃德新,易俊波,李凌云,林楓.  生物工程學(xué)報(bào). 2006(06)
[10]廣西黃雞β-防御素Gal-4基因的克隆和體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)[J]. 謝青梅,陳燕珊,馬靜云,陳俊偉,畢英佐,曹永長.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2006(08)



本文編號：3480144