本試驗(yàn)旨在探究不同方法提取娟姍牛乳源性外泌體的優(yōu)缺點(diǎn)。采用差速超速離心法和試劑盒法2種提取方法對(duì)娟姍牛乳源性外泌體進(jìn)行提取,通過(guò)透射電鏡（TEM）、Bradford蛋白定量、免疫印跡（WB）和粒徑分析（NTA）方法對(duì)2種提取方法得到的外泌體進(jìn)行比較鑒定,并采用細(xì)胞毒性試驗(yàn)對(duì)試劑盒法提取的外泌體進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)估。結(jié)果顯示:2種提取方法均獲得了茶托樣結(jié)構(gòu)的囊泡,但TEM視野下試劑盒法提取的外泌體較差速超速離心法多。試劑盒法提取的外泌體蛋白濃度顯著高于差速超速離心法（P<0.05）。2種提取方法均能夠檢測(cè)到外泌體的標(biāo)志性蛋白凋亡連接基因2相互作用蛋白X（ALIX）和四次跨膜蛋白（CD81）;差速超速離心法提取的外泌體CD81蛋白豐度極低,且并未鑒定出標(biāo)志性蛋白腫瘤敏感基因101蛋白（TSG101）,但試劑盒法檢測(cè)到了TSG101。2種提取方法得到的外泌體粒徑分布均符合外泌體的正常粒徑大小（30～150 nm）。進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),試劑盒法提取的外泌體對(duì)細(xì)胞的增殖分化幾乎沒(méi)有影響。因此,基于本試驗(yàn)條件下,試劑盒法更適用于提取娟姍牛乳源性外泌體。 

【文章來(lái)源】：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào). 2020,32(11)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：7 頁(yè)

【部分圖文】：

外泌體的粒徑檢測(cè)結(jié)果

從圖1可以看出，通過(guò)TEM方法分別對(duì)差速超速離心法及試劑盒法提取得到的外泌體進(jìn)行了鑒定，2種提取方法得到的外泌體都拍到了典型的茶托樣結(jié)構(gòu)，電鏡下觀察到的囊泡大小在100 nm左右。圖1-A為差速超速離心法提取得到的外泌體，電鏡下觀察到的外泌體較少；圖1-B為試劑盒法提取得到的外泌體，電鏡下觀察到的外泌體較多。2.2 Bradford蛋白定量方法鑒定不同方法提取的娟姍牛乳源性外泌體的蛋白濃度

從圖3可以看出，通過(guò)對(duì)不同提取方法提取的外泌體的蛋白進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，圖3-A中差速超速離心法提取的蛋白條帶很雜，在相對(duì)蛋白分子量大的部分，蛋白條帶很弱，在相對(duì)蛋白分子量小的位置，條帶不規(guī)則；試劑盒法提取的各蛋白條帶都比較清晰，蛋白條帶也較多。通過(guò)WB方法對(duì)差速超速離心法和試劑盒法提取的外泌體進(jìn)行了標(biāo)志性蛋白CD81、ALIX和TSG101的鑒定，結(jié)果顯示，2種提取方法均能夠檢測(cè)到外泌體的標(biāo)志性蛋白ALIX和CD81，但差速超速離心法提取的外泌體標(biāo)志性蛋白CD81蛋白豐度特別低，且并未鑒定出標(biāo)志性蛋白TSG101，但試劑盒法檢測(cè)到了標(biāo)志性蛋白TSG101,Calnexin作為外泌體陰性對(duì)照，2種提取方法均未檢測(cè)到Calnexin（圖3-B）。2.4 NTA方法鑒定不同方法提取的娟姍牛乳源性外泌體的粒徑

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3479393