為了利用CRISPR/Cas9技術(shù)高通量篩選介導豬瘟病毒入侵的功能性受體,試驗首先用融合PCR技術(shù),將Venus基因融合至N^pro蛋白的第13位與14位氨基酸之間,獲得全長感染性克隆pCSFV-Venus;之后將pCSFV-Venus轉(zhuǎn)染至SK6細胞拯救重組豬瘟病毒（rCSFV-Venus）,并將拯救的病毒感染豬腎細胞（PK-15細胞）進行連續(xù)傳代觀察其穩(wěn)定性;最后將rCSFV-Venus和表達EGFP的重組病毒rCSFV-EGFP以相同劑量感染PK-15細胞,通過流式細胞儀分析熒光強度及感染效率。結(jié)果表明:rCSFV-Venus全長感染性克隆構(gòu)建成功;轉(zhuǎn)染后傳至第4代可觀察到綠色熒光,表明重組病毒拯救成功;將拯救的病毒連續(xù)傳代10代,每代感染的PK-15細胞都可觀察到綠色熒光,表明重組病毒具有良好的穩(wěn)定性;流式細胞儀分析結(jié)果表明,rCSFV-Venus比rCSFV-EGFP熒光強度強且感染效率高。說明本研究成功拯救了穩(wěn)定表達Venus基因的rCSFV-Venus,為篩選介導CSFV入侵的功能性受體提供了有力工具。 

【文章來源】：黑龍江畜牧獸醫(yī). 2020,(20)北大核心

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

重組病毒的構(gòu)建策略

pCSFV-Venus感染性克隆的構(gòu)建結(jié)果

將鑒定正確的pCSFV-Venus全長感染性克隆轉(zhuǎn)染至SK6細胞中,轉(zhuǎn)染24 h后即可觀察到綠色熒光,而空白對照未觀察到熒光(見158頁彩圖3)。之后進行3次細胞傳代,至第4代仍然可觀察到綠色熒光。用豬瘟抗原試劑盒檢測第4～6代病毒Erns蛋白的表達情況(見圖4),表明rCSFV-Venus重組病毒拯救成功。3.3 rCSFV-Venus重組病毒的體外生長特性分析


本文編號：3471561