豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）率屬于冠狀病毒科中的一員，是豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）的病原，以水樣腹瀉和仔豬高死亡率為主要特征。PEDV N蛋白是目前研究發(fā)現(xiàn)在感染細(xì)胞中產(chǎn)量最多的蛋白，與病毒的致病性息息相關(guān)，因此對PEDV及PEDV N蛋白與細(xì)胞相互作用開展研究，有助于了解PEDV的致病機(jī)制，并為抗病毒策略提供依據(jù).本研究首先針對PEDV與Vero E6細(xì)胞相互作用進(jìn)行研究。將本實(shí)驗(yàn)保存的PEDV感染VeroE6細(xì)胞，分別在感染后4h、8h、12h、24h、36h、48h、72h消化處理細(xì)胞，借助流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化。分析結(jié)果顯示，在Vero E6細(xì)胞感染PEDV12h后可觀察到細(xì)胞在G2/M期停滯的現(xiàn)象。結(jié)果表明PEDV可能與VeroE6細(xì)胞相互作用來影響細(xì)胞在G2/M期的進(jìn)程。利用含有抑制細(xì)胞周期的化學(xué)藥物諾考達(dá)唑（60ng/mL）的培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero E6細(xì)胞，36h后借助流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，可觀察到細(xì)胞在G2/M期的停滯現(xiàn)象；利用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)VeroE6細(xì)胞... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 PED 概述
        1.1.1 流行病學(xué)
        1.1.2 臨床癥狀
        1.1.3 發(fā)病機(jī)理
        1.1.4 病理變化
        1.1.5 組織嗜性和免疫機(jī)制
        1.1.6 免疫防治措施
        1.1.7 診斷
    1.2 PEDV 的生物學(xué)特性
        1.2.1 PEDV 病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)
        1.2.2 PEDV 理化特性
        1.2.3 PEDV 抗原性
        1.2.4 PEDV 病毒學(xué)分類
        1.2.5 PEDV 細(xì)胞培養(yǎng)特性
        1.2.6 PEDV 基因組結(jié)構(gòu)
        1.2.7 PEDV 基因組編碼蛋白及其功能
            1.2.7.1 非結(jié)構(gòu)蛋白及其功能
            1.2.7.2 結(jié)構(gòu)蛋白及其功能
    1.3 冠狀病毒及其蛋白與宿主細(xì)胞周期相互作用的研究進(jìn)展
    1.4 本研究的目的與意義
第二章 感染豬流行性腹瀉病毒對 VERO E6 細(xì)胞周期的影響
    摘要
    2.1 材料與方法
        2.1.1 病毒與細(xì)胞株
        2.1.2 主要試劑和儀器
        2.1.3 PEDV 的培養(yǎng)
        2.1.4 細(xì)胞周期的檢測
        2.1.5 細(xì)胞的化學(xué)處理及檢測
        2.1.6 病毒 RNA 的提取
        2.1.7 病毒 RNA 的反轉(zhuǎn)錄
        2.1.8 病毒載量的檢測
        2.1.9 數(shù)據(jù)的處理和分析
        2.1.10 相對熒光定量對細(xì)胞周期因子及相關(guān)因子的檢測
            2.1.10.1 熒光定量引物的設(shè)計(jì)
            2.1.10.2 細(xì)胞總 RNA 的提取與反轉(zhuǎn)錄
            2.1.10.3 常規(guī) PCR 鑒定
            2.1.10.4 PCR 產(chǎn)物的膠回收
            2.1.10.5 純化產(chǎn)物與載體的連接
            2.1.10.6 連接產(chǎn)物的的轉(zhuǎn)化
            2.1.10.7 重組質(zhì)粒的提取
            2.1.10.8 熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
            2.1.10.9 熒光定量 PCR 細(xì)胞培養(yǎng)物樣品檢測
            2.1.10.11 數(shù)據(jù)處理與分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 細(xì)胞周期的檢測
        2.2.2 化學(xué)藥物處理細(xì)胞
        2.2.3 絕對熒光定量 PCR 的方法檢測病毒載量的變化
        2.2.4 相對熒光定量 PCR 方法檢測細(xì)胞周期調(diào)控因子的變化
    2.3 討論
第三章 豬流行性腹瀉病毒 N 蛋白核仁定位信號對細(xì)胞周期的影響
    摘要
    3.1 材料、儀器和方法
        3.1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞
        3.1.2 主要試劑和儀器
        3.1.3 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.1.3.1 目的基因引物的設(shè)計(jì)
            3.1.3.2 目的基因的擴(kuò)增
            3.1.3.3 N1 和 N2 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化回收
            3.1.3.4 dN 基因的擴(kuò)增
            3.1.3.5 N 基因和 dN 基因擴(kuò)增基因產(chǎn)物的純化回收
            3.1.3.6 N 基因、dN 基因和載體的酶切連接
            3.1.3.7 轉(zhuǎn)化
            3.1.3.8 質(zhì)粒的提取與鑒定
            3.1.3.9 陽性質(zhì)粒的大量提取
        3.1.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Vero E6 細(xì)胞
        3.1.5 激光共聚焦顯微鏡分析
        3.1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 N 基因和 dN 基因的獲得
        3.2.2 激光共聚焦顯微鏡分析重組質(zhì)粒表達(dá)的蛋白在細(xì)胞中的定位情況
        3.2.3 細(xì)胞流式儀檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的周期變化
    3.3 討論
第四章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬流行性腹瀉病毒核衣殼蛋白與感染細(xì)胞核磷蛋白的共定位分析[J]. 呂茂杰,陳建飛,時洪艷,陳小金,范秀萍,申識川,馮力.  微生物學(xué)報(bào). 2011(05)
[2]豬流行性腹瀉病毒基因及其疫苗的研究[J]. 王鳳,湯德元,李春燕,王彬,張曉杰,甘振磊,劉志杰.  豬業(yè)科學(xué). 2010(12)
[3]豬流行性腹瀉病毒CH/S株N蛋白基因的遺傳變異及其原核表達(dá)[J]. 陳建飛,馮力,時洪艷,孫東波,白興華,佟有恩.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2007(11)
[4]SARS冠狀病毒核衣殼蛋白抑制胞質(zhì)分裂和細(xì)胞增值[J]. 劉俊麗,馮怡,李楚芳,曹誠,馬清鈞.  生物技術(shù)通訊. 2006(02)
[5]豬病毒性腹瀉疾病的預(yù)防[J]. 馮力,時洪艷,陳建飛.  養(yǎng)豬. 2005(05)
[6]流行性腹瀉病毒M基因與甲病毒載體重組RNA的構(gòu)建[J]. 余麗蕓,侯喜林.  動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2005(05)
[7]豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯(lián)弱毒疫苗的研究[J]. 佟有恩,馮力,李偉杰,朱遠(yuǎn)茂,王明,馬思奇.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 1999(06)
[8]豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯(lián)氫氧化鋁細(xì)胞滅活疫苗的研究[J]. 馬思奇,王明,馮力,李偉杰.  中國畜禽傳染病. 1995(06)
[9]豬流行性腹瀉病毒適應(yīng)Vero細(xì)胞培養(yǎng)及以傳代細(xì)胞毒制備氫氧化鋁滅活疫苗免疫效力試驗(yàn)[J]. 馬思奇,王明,周金法,馮力.  中國畜禽傳染病. 1994(02)
[10]豬流行性腹瀉免疫病理學(xué)研究Ⅳ.胃腸道IgA、IgM和IgG產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)及其分泌液和血清中IgA、IgM和IgG含量動態(tài)觀察[J]. 劉偉杰,張遠(yuǎn)鈺.  獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 1989(03)



本文編號：3451197