吻素（Kisspeptin,Kp）是由KISS1基因編碼的神經(jīng)肽,在哺乳動(dòng)物生殖器官發(fā)育、初情期啟動(dòng)、季節(jié)性發(fā)情、精子發(fā)生、卵泡成熟與排卵等生殖內(nèi)分泌調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。Kisspeptin在動(dòng)物繁殖中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值,而現(xiàn)在商品化的Kisspeptin藥品卻十分昂貴。本研究旨在用畢赤酵母表達(dá)綿羊吻素Kp53,并對(duì)其生物活性進(jìn)行測(cè)定,為其在動(dòng)物繁殖中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。根據(jù)畢赤酵母的偏好密碼子對(duì)綿羊Kp53的編碼序列進(jìn)行優(yōu)化,將其克隆到p PICZαA質(zhì)粒構(gòu)建成重組表達(dá)載體p PICZαA-Kp53。將鑒定正確的重組質(zhì)粒與空質(zhì)粒經(jīng)Sac I線性化后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115。甲醇誘導(dǎo)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子表達(dá),用BCA法檢測(cè)發(fā)酵上清液總蛋白濃度,并以Tricine-SDS-PAGE和Western Blot對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。為了提高表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度及甲醇濃度等條件進(jìn)行了優(yōu)化。用Ni親和層析柱法純化目的產(chǎn)物。最后,向昆明小鼠腹腔注射純化產(chǎn)物,通過(guò)其對(duì)生殖激素LH和FSH水平的影響評(píng)估表達(dá)產(chǎn)物的生物活性。研究構(gòu)建的重組表達(dá)載體p PICZαA-Kp53能夠在畢赤酵母基因工程菌... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

綿羊KISS1基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后加工及神經(jīng)肽前體的結(jié)構(gòu)和不同的前體裂解產(chǎn)物Fig.1-1Thetranscription,translation,andpost-translationalprocessingofsheepKISS1gene,andthestructureofprepro-kisspeptin,andmajorpeptideproductsgeneratedbydifferentialcleavagefromthecommonprecursor.

綿羊 Kisspeptin-53 基因表達(dá)及生物活性檢測(cè)在視前區(qū)（POA）中 Kisspeptin 表達(dá)水平?jīng)]有變化（Clarke et al 2009）。Smith 等也：盡管弓狀核中的 KISS1 神經(jīng)元的季節(jié)性表達(dá)水平變化是明顯的，但位于視前區(qū)（PO那些神經(jīng)元似乎不受季節(jié)性變化的影響（Smith and Clarke 2007）。摘除卵巢的母羊射雌激素替代品的母羊，在沒(méi)有性類固醇激素反饋的情況下，KISS1 表達(dá)水平在繁殖的上升也是明顯的（Smith et al 2008）。雌激素對(duì)弓狀核（ARC）中 KISS1 表達(dá)的抑用在非繁殖季節(jié)比繁殖季節(jié)更強(qiáng)（Smith et al 2008），表明 KISS1 神經(jīng)元對(duì)雌激素敏的變化是決定季節(jié)性繁殖的關(guān)鍵因素。解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：與非發(fā)情季節(jié)相比，發(fā)情季綿羊大腦漏斗部有大量的 Kisspeptin 神經(jīng)元末端與 GnRH 神經(jīng)元之間存在軸突-胞體突-樹突與軸突-軸突的聯(lián)系（Smith 2012）（圖 1-2）。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明 Kisspeptin 表達(dá)元可能直接參與對(duì) GnRH 神經(jīng)分泌的調(diào)控。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文的研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊等一些哺乳動(dòng)物的弓狀核（ARC）中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特殊神經(jīng)元群，在這個(gè)神經(jīng)元群中，Kisspeptin 神經(jīng)與神經(jīng)激肽 B（neurokininB）和強(qiáng)啡肽（dynorphin）神經(jīng)元位于同一區(qū)域，即 Kisspeptin 神經(jīng)元共表達(dá)另外兩類神經(jīng)元，該神經(jīng)元群被統(tǒng)稱為KNDy 神經(jīng)元。在 KNDy 神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中，NeurokininB 對(duì) KISS1 神經(jīng)元起促進(jìn)作用，而Dynorphin 對(duì)其起抑制作用，它們共同協(xié)調(diào)作用來(lái)調(diào)節(jié) Kisspeptin 的釋放，進(jìn)而調(diào)節(jié) GnRH神經(jīng)元的脈沖釋放（Lehman et al 2010, Goodman et al 2013）（圖 1-4），影響動(dòng)物的生殖內(nèi)分泌節(jié)律。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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