豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是導(dǎo)致豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的致病病原,PRRSV對(duì)易感細(xì)胞有著嚴(yán)格的細(xì)胞趨向性,該病毒主要感染單核-巨噬細(xì)胞系,包括其天然易感宿主細(xì)胞--豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）。PRRSV入侵易感細(xì)胞系需要多種因子的介導(dǎo),包括CD163,非肌肉肌球蛋白重鏈9（MYH9）,唾液酸黏附素（Sn）,硫酸乙酰肝素（HS）,Vimentin,CD151,CD209等。前人以及本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果顯示,CD163和MYH9是PRRSV入侵易感細(xì)胞的兩個(gè)不可或缺的受體或輔助受體蛋白,但是這兩個(gè)蛋白在病毒感染過(guò)程中是否存在相互作用還未可知。因此,本研究對(duì)CD163與MYH9的相互作用及其在PRRSV入侵易感細(xì)胞系中的作用機(jī)制展開(kāi)了一系列的探討。主要得到以下結(jié)果:1.通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)CD163和MYH9在PRRSV天然宿主細(xì)胞PAMs中存在相互作用現(xiàn)象,并且該互作并不依賴于病毒的感染狀態(tài)。2.在HEK293T細(xì)胞中,我們將構(gòu)建的CD163和MYH9截短表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CD163氨基端4個(gè)串聯(lián)重復(fù)的SRCR結(jié)構(gòu)域SRCR1-4與MYH9羧基... 

【文章來(lái)源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 豬繁殖與呼吸綜合征病毒研究進(jìn)展
    1.1 PRRSV起源
    1.2 PRRSV臨床癥狀
    1.3 PRRSV病理變化
    1.4 PRRSV基因組組成
    1.5 PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白
    1.6 PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白
    1.7 PRRSV疫苗防控
第二章 豬繁殖與呼吸綜合征病毒受體研究進(jìn)展
    2.1 CD163
    2.2 非肌肉肌球蛋白重鏈 9(MYH9)
    2.3 唾液酸黏附素(Sn)
    2.4 其他受體分子
    2.5 本研究的目的與意義
第三章 CD163與MYH9互作區(qū)域鑒定
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 細(xì)胞,質(zhì)粒和病毒
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與主要耗材
        3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備
        3.1.4 主要緩沖液配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PAMs內(nèi)CD163與MYH9的互作
        3.2.2 PAMs膜蛋白提取
        3.2.3 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CD163與MYH9的互作區(qū)域
        3.2.4 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)
        3.2.5 原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化蛋白
        3.2.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)SRCR1-4 與PRA蛋白的直接互作
        3.2.7 Far-Western Blot檢測(cè)SRCR1-4 與PRA的直接互作
        3.2.8 Confocal驗(yàn)證重組表達(dá)的SRCR1-4 與PAMs細(xì)胞膜上MYH9的共定位
        3.2.9 免疫共沉淀驗(yàn)證重組表達(dá)的SRCR1-4 與PAMs細(xì)胞膜上MYH9的互作
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 CD163與MYH9在PAMs中相互作用
        3.3.2 CD163蛋白的N端結(jié)構(gòu)域SRCR1-4 與MYH9蛋白的C端區(qū)域PRA相互作用
        3.3.3 SRCR1-4 蛋白表達(dá)與純化
        3.3.4 SRCR1-4 與PRA直接相互作用
        3.3.5 SRCR1-4 蛋白與PAMs膜上分布的MYH9相互作用
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 SRCR1-4 與PRA的互作對(duì)PRRSV感染的影響
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 細(xì)胞,質(zhì)粒和病毒
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和主要耗材
        4.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 穩(wěn)定表達(dá)CD163及其截短片段的HEK293T細(xì)胞系構(gòu)建
        4.2.2 免疫共沉淀檢測(cè)HEK293T細(xì)胞系中CD163與MYH9的互作
        4.2.3 PRRSV在HEK293T穩(wěn)篩細(xì)胞系中吸附,內(nèi)化,解離,復(fù)制過(guò)程的分析
        4.2.4 PRRSV在HEK293TCD163,HEK293TSRCR1-4,HEK293TSRCR5-CT細(xì)胞系中的復(fù)制差異分析
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 HEK293T~(CD163),HEK293T~(SRCR1-4),HEK293T~(SRCR5-CT)細(xì)胞系的建立與鑒定
        4.3.2 HEK293T~(CD163),HEK293T~(SRCR1-4),HEK293T~(SRCR5-CT)細(xì)胞系中CD163與MYH9的互作
        4.3.3 SRCR1-4 對(duì)于PRRSV在易感細(xì)胞內(nèi)的入侵發(fā)揮重要作用
        4.3.4 SRCR1-4 的表達(dá)影響PRRSV的復(fù)制效率
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 重組表達(dá)SRCR1-4 蛋白對(duì)PRRSV感染的抑制作用
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 細(xì)胞,病毒和蛋白
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和主要耗材
        5.1.3 主要儀器設(shè)備
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 原核表達(dá)的SRCR1-4 蛋白對(duì)PRRSV在PAMs中內(nèi)化的影響
        5.2.2 不同濃度的SRCR1-4 蛋白孵育PAMs后對(duì)II型PRRSV的抑制作用
        5.2.3 SRCR1-4 蛋白對(duì)細(xì)胞的毒性檢測(cè)
        5.2.4 重組SRCR1-4 蛋白對(duì)I,II型PRRSV的廣譜性抑制作用
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 重組SRCR1-4 蛋白抑制PRRSV在PAMs中的內(nèi)化過(guò)程
        5.3.2 重組SRCR1-4 蛋白對(duì)PRRSV具有廣譜性抑制作用
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
第六章 CD163與MYH9互作區(qū)域的表達(dá)與純化
    6.1 實(shí)驗(yàn)材料
        6.1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒
        6.1.2 主要試劑耗材
        6.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備
    6.3 實(shí)驗(yàn)方法
        6.3.1 Far-Western Blot鑒定SRCR1-4 蛋白與截短PRA片段之間的互作
        6.3.2 His-pull down檢測(cè)SRCR1-4 與截短PRA蛋白之間的相互作用
        6.3.3 SRCR1-4 與PRA互作區(qū)域的表達(dá)純化
        6.3.4 真核表達(dá)的PRA100與原核表達(dá)的SRCR1-4 蛋白之間的互作檢測(cè)
        6.3.5 穩(wěn)定分泌表達(dá) CD163 胞外區(qū)蛋白（SRCR1-PSTII）的 293s 懸浮細(xì)胞系構(gòu)建
        6.3.6 SRCR1-PSTII蛋白的純化
        6.3.7 SRCR1-PSTII蛋白透射電鏡觀察
    6.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        6.4.1 CD163 SRCR1-4 蛋白與PRA截短片段之間的互作
        6.4.2 PRA100蛋白的表達(dá)純化
        6.4.3 真核表達(dá)的PRA100與原核表達(dá)SRCR1-4 蛋白之間的互作
        6.4.4 CD163胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域SRCR1-PSTII蛋白的表達(dá)與純化
        6.4.5 SRCR1-PSTII透射電鏡觀察
    6.5 討論
    6.6 小結(jié)
全文總結(jié)
本研究創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Review for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus[J]. Tao XING,Xingxing YU,Jun ZHANG,Hongfei ZHANG,Haigen WANG,Guangsheng ZHOU,Min ZHANG,Chuanmin LIU,Jingui LI.  Agricultural Science & Technology. 2017(01)

博士論文
[1]豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗獨(dú)特型抗體Mab2-5G2與MYH9蛋白互作的研究[D]. 李亮亮.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2018



本文編號(hào)：3432623