豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染引起一種急性、高度傳染的病毒性傳染病，對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2006年，我國出現(xiàn)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV），加大了對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害。目前，病毒仍在持續(xù)的進(jìn)化，在世界范圍內(nèi)受到廣泛關(guān)注。PRRSV難以控制的原因之一在于病毒的致病和免疫機(jī)理并不十分清楚，因此，難以研發(fā)安全、有效的疫苗來對(duì)該病進(jìn)行防控。病毒侵入機(jī)體后，機(jī)體對(duì)侵入的病毒產(chǎn)生一定的限制和清除作用。病毒如何調(diào)控細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路或利用自身編碼蛋白來逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別和清除，從而有利于自身的感染和復(fù)制，成為近年來針對(duì)PRRSV研究的熱點(diǎn)。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，多種病毒感染過程中均能夠活化該通路來有利于自身的復(fù)制和增殖。SAMHD1作為最新發(fā)現(xiàn)的天然免疫限制性因子，具有三磷酸水解酶的活性，能夠降解細(xì)胞內(nèi)d... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：118 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒概述
    1.2 PRRSV 的基因組結(jié)構(gòu)與復(fù)制機(jī)制
        1.2.1 PRRSV 的基因組結(jié)構(gòu)
        1.2.2 PRRSV 的復(fù)制機(jī)制
    1.3 PRRSV 編碼蛋白
        1.3.1 PRRSV 的非結(jié)構(gòu)蛋白
        1.3.2 PRRSV 的結(jié)構(gòu)蛋白
    1.4 PRRSV 感染與先天性免疫
        1.4.1 Toll 樣受體信號(hào)
        1.4.2 RIG-I 樣受體信號(hào)
        1.4.3 JAK-STAT 信號(hào)通路
        1.4.4 PRRSV 感染對(duì)天性免疫的調(diào)控
    1.5 PI3K/Akt 信號(hào)通路
        1.5.1 PI3K 結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能
        1.5.2 Akt 通路及其生物學(xué)功能
        1.5.3 PI3K/Akt 通路與 PRRSV 感染
    1.6 天然免疫限制性因子 SAMHD1 與病毒感染
        1.6.1 SAMHD1 的結(jié)構(gòu)與功能
        1.6.2 SAMHD1 與病毒感染
    1.7 本研究目的和意義
第二章 PRRSV 感染調(diào)控 PI3K/Akt 信號(hào)通路的研究
    2.1 材料和方法
        2.1.1 病毒和細(xì)胞
        2.1.2 抗體和試劑
        2.1.3 病毒滅活
        2.1.4 病毒感染和抑制劑處理
        2.1.5 抑制劑細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
        2.1.6 HuN4-F112 株 GSK-3 抑制劑突變株的篩選
        2.1.7 細(xì)胞裂解和 Western blot 分析
        2.1.8 總 RNA 的提取與 cDNA 的合成
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 HuN4 感染活化 Akt 信號(hào)通路
        2.2.2 LY294002 和 GSK-3 inhibitor X 對(duì)細(xì)胞活性的影響
        2.2.3 HuN4 感染 MARC-145 細(xì)胞導(dǎo)致 Akt 磷酸化上調(diào)受 PI3K 調(diào)控
        2.2.4 滅活病毒誘導(dǎo) PAM 細(xì)胞 Akt 早期磷酸化
        2.2.5 HP-PRRSV 感染調(diào)控 Akt 下游分子 FoxO1、Bad 促進(jìn)自身增殖
        2.2.6 抑制 Akt 的磷酸化影響細(xì)胞病變（CPE）的形成
        2.2.7 Akt 下游分子 GSK-3 的活性與 HuN4 的增殖相關(guān)
        2.2.8 HuN4-F112 株 GSK-3 抑制劑突變株的篩選
    2.3 討論
第三章 豬 SAMHD1 基因序列擴(kuò)增及單克隆抗體的制備
    3.1 材料與方法
        3.1.1 細(xì)胞與樣品
        3.1.2 質(zhì)粒、抗體和試劑
        3.1.3 總 RNA 的提取與 cDNA 的合成
        3.1.4 豬 SAMHD1 全基因序列擴(kuò)增
        3.1.5 豬 SAMHD1 蛋白原核表達(dá)與純化
    3.2 豬 SAMHD1 蛋白單克隆抗體的制備
        3.2.1 小鼠免疫
        3.2.2 單克隆抗體的制備
        3.2.3 單克隆抗體效價(jià)與特異性鑒定
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 SAMHD1 全基因序列擴(kuò)增
        3.3.2 豬 SAMHD1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3.3 重組豬 SAMHD1 表達(dá)、純化與鑒定
        3.3.4 豬 SAMHD1 單克隆抗體的制備、效價(jià)測定與特異性鑒定
        3.3.5 IFA 檢測內(nèi)源性豬 SAMHD1 表達(dá)
    3.4 討論
第四章 豬 SAMHD1 組織細(xì)胞定位及抗病毒作用的研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 細(xì)胞與病毒
        4.1.2 質(zhì)粒、抗體及試劑
        4.1.3 總 RNA 提取與 cDNA 的合成
        4.1.4 豬 SAMHD1 基因序列分析
        4.1.5 真核表達(dá)載體的構(gòu)建與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
        4.1.6 SAMHD1 亞細(xì)胞定位與組織分布
        4.1.7 過表達(dá) SAMHD1 對(duì) HP-PRRSV 的影響
        4.1.8 IFA 檢測 HP-PRRSV 的增殖
        4.1.9 Strand-specific quantitative RT-PCR (qRT-PCR)檢測 HP-PRRSV 增殖
        4.1.10 干擾素刺激因子 ISG15 和 ISG56 表達(dá)量檢測
        4.1.11 Phos-Tag~(TM)SDS-PAGE 電泳及 western blot 分析
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 豬 SAMHD1 基因序列分析
        4.2.2 豬 SAMHD1 亞細(xì)胞定位與組織分布
        4.2.3 過表達(dá) SAMHD1 顯著抑制 HuN4 在 MARC-145 細(xì)胞中的增殖
        4.2.4 過表達(dá) SAMHD1 蛋白主要以非磷酸化形式存在
        4.2.5 過表達(dá) SAMHD1 抑制 HuN4 病毒 cRNA 鏈的合成
        4.2.6 過表達(dá) SAMHD1 顯著上調(diào) ISG15 和 ISG56 的轉(zhuǎn)錄
    4.3 討論
第五章 SAMHD1 表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究
    5.1 材料和方法
        5.1.1 病毒和細(xì)胞
        5.1.2 質(zhì)粒、抗體和試劑
        5.1.3 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.1.4 Real-time PCR 定量分析 SAMHD1 基因 mRNA 表達(dá)量
        5.1.5 細(xì)胞處理與轉(zhuǎn)染
        5.1.6 熒光素酶活性檢測
        5.1.7 RNA 干擾與回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 IFN-α能顯著誘導(dǎo) MARC-145 細(xì)胞和 PAM 細(xì)胞中 SAMHD1 的上調(diào)表達(dá)
        5.2.2 TLR3 和 RIG-I 通路參與 SAMHD1 上調(diào)表達(dá)
        5.2.3 TBK1 參與 SAMHD1 的誘導(dǎo)表達(dá)
        5.2.4 活化的 IRFs 誘導(dǎo) SAMHD1 的表達(dá)
        5.2.5 NDV 感染通過磷酸化 IRF-3 上調(diào)表達(dá) SAMHD1
        5.2.6 抑制 IRF-3 的磷酸化入核無法誘導(dǎo) SAMHD1 上調(diào)表達(dá)
    5.3 討論
第六章 PRRSV 感染調(diào)控 SAMHD1 機(jī)制的研究
    6.1 材料與方法
        6.1.1 細(xì)胞與病毒
        6.1.2 質(zhì)粒、抗體和試劑
        6.1.3 細(xì)胞樣品收取與 real-time RT-PCR 分析 SAMHD1 mRNA 表達(dá)
        6.1.4 Phos-Tag~(TM)SDS-PAGE 電泳及 western blot
        6.1.5 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)
        6.1.6 RNA 干擾實(shí)驗(yàn)
        6.1.7 抑制劑處理細(xì)胞和病毒感染
    6.2 結(jié)果
        6.2.1 PRRSV 感染 MARC-145 細(xì)胞和 PAM 細(xì)胞 SAMHD1 表達(dá)具有一定的差異
        6.2.2 HuN4 感染 MARC-145 細(xì)胞抑制 IRF-3 的磷酸化
        6.2.3 HuN4 病毒感染通過阻止 IRF-3 入核來抑制 SAMHD1 的上調(diào)表達(dá)
        6.2.4 HuN4 感染 MARC-145 細(xì)胞直接抑制 IRF-3 的磷酸化
        6.2.5 HuN4 感染 PAM 細(xì)胞上調(diào) IRF-3 的磷酸化
        6.2.6 HuN4 感染 PAM 細(xì)胞通過 RIG-I/MDA5/TBK1 通路激活 IRF-3
        6.2.7 PAM 細(xì)胞中抑制 IRF-3 的磷酸化入核阻止 SAMHD1 的上調(diào)表達(dá)
        6.2.8 抑制 PAM 細(xì)胞中 SAMHD1 上調(diào)表達(dá)促進(jìn) HuN4 病毒的增殖
        6.2.9 MARC-145 細(xì)胞 SAMHD1 處于磷酸化狀態(tài)
        6.2.10 PK-15 細(xì)胞中 SAMHD1 處于磷酸化狀態(tài)
        6.2.11 MARC-145 細(xì)胞中 SAMHD1 與 CyclinA2/CDK1 互作
        6.2.12 PRRSV 感染 MARC-145 細(xì)胞促進(jìn) CDK1 的活性
        6.2.13 抑制 CyclinA2/CDK1 復(fù)合體的功能能夠阻止 HuN4 病毒的增殖
        6.2.14 干擾 MARC-145 細(xì)胞中 SAMHD1 的表達(dá)對(duì) HuN4 增殖沒有顯著影響
        6.2.15 PRRSV 感染 PAM 細(xì)胞 SAMHD1 處于非磷酸化狀態(tài)
        6.2.16 IFN-α誘導(dǎo) SAMHD1 表達(dá)以非磷酸化形式存在
    6.3 討論
第七章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡歷



本文編號(hào)：3392903