試驗旨在對水牛pri-miR-16b基因進行克隆并構建腺病毒表達載體,且對水牛miR-16b及其預測靶基因進行生物信息學分析,為研究其在水牛卵母細胞成熟過程中的作用奠定基礎。利用RT-PCR技術從水牛卵巢基因組中擴增pri-miR-16b基因,采用同源重組的方法構建pDC316-mCMV-EGFP-pri-miR-16b質粒;利用BLAST程序進行同源性分析,Mega 7.0構建系統(tǒng)進化樹,ViennaRNA Web Services預測pre-miR-16b的二級結構。對腺病毒質粒與腺病毒骨架質粒pBHGloxdelE13cre進行包裝,經過3次擴增獲得含有pri-miR-16b的腺病毒顆粒,將獲得的病毒顆粒命名為Ad-miR-16b,并進行病毒滴度測定;利用Ad-miR-16b感染水牛卵丘細胞,實時熒光定量PCR檢測miR-16b在卵丘細胞中的表達情況。利用TargetScan對miR-16b進行靶基因預測,對預測的靶基因進行KEGG通路富集。結果顯示,試驗成功克隆水牛pri-miR-16b序列,通過比對發(fā)現(xiàn)與牛的序列相似性分別為100%,與其他物種同源性較高,和黃牛的親緣關系最近... 

【文章來源】：中國畜牧獸醫(yī). 2020,47(08)北大核心

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pDC316-mCMV-EGFP-pri-miR-16b腺病毒質粒

試驗成功擴增出493 bp的pri-miR-16b序列,膠回收目的片段;pDC316-mCMV-EGFP質粒經Hind Ⅲ酶切處理,膠回收線性化質粒,用重組酶連接,酶切鑒定正確后(圖2),送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結果與牛pri-miR-16b序列基本一致。2.2 pre-miR-16b序列分析

將測序得到的水牛pre-miR-16b序列通過RNAfold獲得pre-miR-16b的二級結構,發(fā)現(xiàn)其帶有典型的單一莖環(huán)結構,且成熟序列位于莖環(huán)結構的5′臂上(圖3)。通過NCBI BLAST將水牛pre-miR-16b與黃牛(登錄號:NR_030891.1)、山羊(登錄號:NR_129608.1)、家兔(登錄號:NR_162460.1)、鴨嘴獸(登錄號:NR_034777.1)、斑胸草雀(登錄號:NR_049124.1)、非洲爪蟾(登錄號:NR_049654.1)、蜥蜴(登錄號:NR_129879.1)和灰短尾鼠(登錄號:NR_127564.1)進行相似性分析。結果顯示,相似性分別為100%、97.8%、92.1%、89.8%、80.8%、76.5%、87.9%和85.7%(圖4)。利用Mega 7.0構建系統(tǒng)進化樹,結果見圖5。由圖5可知,水牛和黃牛同屬�？�,聚為一支,親緣關系最近。圖4 水牛與其他物種pre-miR-16b基因同源性比對

【參考文獻】：
期刊論文
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