豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的病毒性傳染病。該病以妊娠母豬發(fā)熱、厭食、早產、流產、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙,新生及斷奶前仔豬高死亡率以及各年齡段尤其是仔豬的呼吸道疾病為特征。1987年該病第一次在美國被發(fā)現(xiàn),1991年在荷蘭分離到該病毒,1996年中國成功分離到了第一株PRRSV CH-1a株。目前該病流行于世界各養(yǎng)豬國家,給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失,是威脅當前養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病之一。目前檢測PRRSV抗體的方法有很多,在臨床上主要是用ELISA的方法檢測,其中以N蛋白和GP5蛋白包被居多,在臨床上都有較高的符合率。本研究主要以純化的重組N蛋白和人工合成的兩個N蛋白抗原（P30和P32）表位做包被抗原,建立方法進行臨床樣本檢測,并和商品化試劑盒（IDEXX和LSI）進行比較。主要研究內容如下：1.PRRSVORF7基因的克隆與表達... 

【文章來源】：華中農業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表
1. 文獻綜述
    1.1 PRRSV的分子生物學特征
        1.1.1 PRRSV基因組結構
        1.1.2 PRRSV非結構蛋白的功能
        1.1.3 PRRSV結構蛋白的功能
    1.2 PRRSV體液免疫和細胞免疫的研究進展
        1.2.1 PRRSV體液免疫研究進展
        1.2.2 PRRSV細胞免疫研究進展
    1.3 PRRSV疫苗研究進展
        1.3.1 弱毒活疫苗
        1.3.2 滅活疫苗
        1.3.3 基因工程疫苗
    1.4 PRRSV診斷方法的研究進展
        1.4.1 臨床癥狀與病理變化
        1.4.2 病毒分離與分子生物學診斷方法
        1.4.3 血清學診斷
    1.5 本研究的目的與意義
2. 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 毒株,菌株,實驗動物和多肽
        2.1.2 載體與試劑
        2.1.3 引物的設計與合成
        2.1.4 抗體
        2.1.5 血清
        2.1.6 SDS-PAGE和Western blot試劑和溶液
        2.1.7 培養(yǎng)基的配制
        2.1.8 間接ELISA所需試劑的配制
        2.1.9 主要儀器
        2.1.10 其他試劑耗材
    2.2 方法
        2.2.1 PRRSV病毒的培養(yǎng)
        2.2.2 PRRSV的RNA提取
        2.2.3 PRRSV ORF7基因的PCR擴增與檢測
        2.2.4 PCR產物的回收和純化
        2.2.5 純化產物和T載體連接
        2.2.6 連接產物轉化到DH5α
        2.2.7 重組質粒的提取
        2.2.8 ORF7基因片段的序列測定及分析
        2.2.9 原核表達載體pET32a-ORF7的構建
        2.2.10 重組表達質粒轉化到大腸桿菌BL_(21)(DE3)感受態(tài)
        2.2.11 重組表達質粒pET32a-ORF7在大腸桿菌BE_(21)(DE3)中的誘導表達
        2.2.12 表達產物的SDS-PAGE分析
        2.2.13 表達產物的純化
        2.2.14 表達產物的Western blot檢測
        2.2.15 PRRSV N蛋白兩個抗原表位的合成肽的分析與合成
        2.2.16 間接ELISA方法的操作程序
        2.2.17 重組N蛋白,P30,P32間接ELISA方法最佳反應條件的確定
3. 結果與分析
    3.1 ORF7基因PCR擴增結果
    3.2 原核表達載體pET32a-ORF7鑒定
    3.3 原核表達載體pET32a-ORF7在大腸桿菌中的誘導表達
    3.4 表達產物的純化
    3.5 純化蛋白的濃度的測定
    3.6 表達產物的Western blot鑒定
    3.7 N蛋白抗原表位的合成肽P30和P32的選取
    3.8 間接ELISA方法最佳反應條件的確定
        3.8.1 合成肽最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)的確定
        3.8.2 最佳二抗稀釋倍數(shù)的確定
        3.8.3 判定標準的確定
        3.8.4 特異性試驗結果
        3.8.5 敏感性試驗
        3.8.6 重復性試驗結果
        3.8.7 臨床樣品檢測
4. 討論
    4.1 PRRSV ORF7基因的選擇
    4.2 N蛋白兩個抗原表位的選擇
    4.3 關于間接ELISA方法的建立
    4.4 建立的ELISA方法和商品化試劑盒的比較
5. 結論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]豬繁殖和呼吸綜合征病毒HuN4株nsp9、nsp10、nsp11對毒力影響的研究[J]. 姜一峰,周艷君,王亞欣,朱建平,虞凌雪,徐彥召,童武,童光志.  中國動物傳染病學報. 2011(06)
[2]異源5′非翻譯區(qū)在豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染性拯救過程中的功能解析[J]. 高飛,陸嘉琦,姚火春,楊倩,袁世山,童光志.  中國動物傳染病學報. 2011(06)
[3]豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結構蛋白NSP4細胞核定位研究[J]. 劉惠莉,方瑩.  南京農業(yè)大學學報. 2011(04)
[4]高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白CD4+ T細胞表位優(yōu)勢區(qū)的鑒定[J]. 方劍玉,鄭其升,郭小參,侯鳳香,王琳,陶紅梅,侯繼波,陳溥言.  南京農業(yè)大學學報. 2011(01)
[5]豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗研究進展[J]. 吳佳俊,遇秀玲,蔣桃珍,田克恭.  中國預防獸醫(yī)學報. 2010(08)
[6]用于DNA轉染的PRRSV全長感染性cDNA克隆改建及應用[J]. 劉長龍,李燕華,袁世山.  安徽農業(yè)科學. 2010(23)
[7]多重RT-PCR區(qū)分PRRSV變異株和經典株方法的建立[J]. 張志成,范紅結,陳鐘鳴,戴鼎震,何小明.  金陵科技學院學報. 2010(02)
[8]豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子生物學研究概況[J]. 朱燕秋.  畜牧獸醫(yī)科技信息. 2010(01)
[9]豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子生物學研究進展[J]. 李國娟,田永強,李建強,李寶玉,柳紀省.  生物技術通報. 2009(12)
[10]豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp10基因的克隆及序列分析[J]. 周思旋,周碧君,隆華,朱時杰,文明,王開功.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2009(19)



本文編號：3356251