布魯菌病是由布魯菌引起的一種人畜共患病,以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征,嚴重威脅人類和許多動物的健康,同時也對畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。本研究以布魯菌Rev.I株基因組為模板,擴增BAB基因序列,將其克隆至原核表達載體pET-30a（+）中,獲得重組質(zhì)粒pET-30a-BAB,并進行原核表達、Western-Blot檢測及其抗體的間接ELISA方法建立。結(jié)果表明:本試驗成功克隆并表達了 BAB基因,經(jīng)SDS-PAGE分析純化后的表達產(chǎn)物顯示,本研究獲得較純蛋白;Western-Blot試驗表明,該基因表達蛋白可與布魯菌羊陽性血清發(fā)生特異性反應,具有良好的反應原性;隨后,以BAB蛋白作為包被抗原,建立并優(yōu)化了檢測BAB抗體的間接ELISA方法。確定最佳包被條件為:BAB蛋白包被量0.25μg/mL,血清稀釋度為1:400;封閉液為3%豬源明膠;二抗稀釋度為1:6000;顯色時間為10 min。通過對臨床40份羊血清的檢測,計算得出臨界值為0.607。當待檢血清OD450值大于等于0.607時,判定為陽性,反之則判定為陰性。建立的BAB間接ELISA方法與SAT及RBPT相比,總符合率達到77.5%。 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２原核表達載體的酶切鑒定??１＾１：１１？１＾１：雙酶切？０１回收產(chǎn)物８八８?２：重組質(zhì)粒??

?內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文?１９＿??３結(jié)果??３．１目的基因擴增結(jié)果??羊種布魯菌Ｒｅｖ．ｌ株ＢＡＢ基因的片段大小為１２４２?ｂｐ，ＰＣＲ擴增產(chǎn)物經(jīng)１％瓊??脂糖凝膠電泳分析，與預期大小相符（圖１）。??Ｍ?１?２?３??２０００ｂｐ＾ｎ＾｜＾｜＾ｌ??７５０ｂｐ??５００ｂｐ??２５〇ｂｐ??圖１?ＰＣＲ擴增或膠回收產(chǎn)物??Ｍ：ｍａｋｅｒ?１－３：?ＰＣＲ?擴增?ＢＡＢ??Ｆｉｇ?．１?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｒ?ｇｅｌ?ｒｅｃｏｖｅｒｙ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ??３．２原核表達載體酶切鑒定結(jié)果??使用價？／／／和Ａ７？ｏ／核酸內(nèi)切酶將重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定后與１％的瓊脂糖凝??膠電泳進行檢測，條帶大小和預期結(jié)果相同（見圖２）。??Ｍ?１?２??＼??３〇ｏ〇ｂｐ??２〇ｏ〇ｂＰＢ０ｓｅ??１５００ｂｐ＾＾ｆｌＨ??ｏｏｏｂｐ??７５０ｂｐ??５〇〇ｂｐ??２５０ｂｐ??ｌＯＯｂｏ?Ｉ??圖２原核表達載體的酶切鑒定??１＾１：１１？１＾１：雙酶切？０１回收產(chǎn)物８八８?２：重組質(zhì)粒??Ｆｉｇ．２?Ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒｓ??

?內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文??２１??３．４重組蛋白的純化結(jié)果??收集洗脫液，取１０ｐＬ與等體積的２ｘｌ〇ａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ均勻混合，１００°Ｃ煮５ｍｉｎ，??電泳檢測結(jié)果如圖５所示。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析顯示，得到較純蛋白。??Ｍ?１??９４ｋＤ?…??６６．２ｋＤ?ｆ??４５ｋＤ??３３ｋＤ?—??２６ｋＤ?？??２０ｋＤ??圖５目的蛋白純化后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳圖??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ?１：純化蛋白稀釋?５?倍?１２％?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ??Ｆｉｇ?．５?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?ｔａｒｇｅｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ??３．５重組蛋白Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ檢測結(jié)果??對誘導３?ｈ后的重組蛋白純化后進行Ｗｅｓｔｅｍ－Ｂｌｏｔ檢測，１４?Ｖ電壓下轉(zhuǎn)膜６０??ｍｉｎ，孵育經(jīng)本實驗室鑒定的羊布魯氏菌陽性血清，可見明顯的目的條帶，說明誘??導得到的重組蛋白能被ＨＲＰ標記的羊抗鼠ＩｇＧ抗體識別，且大小與ｐＥＴ－３０ａ分子??質(zhì)量加上目標分子蛋白質(zhì)量的重組蛋白總分子質(zhì)量相符（見圖６）。??

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：3331582