近年來,隨著人們生活水平的提高,高血脂、動脈粥樣硬化、心肌梗死等心血管疾病已成為危害人類身體健康的頭號殺手。血脂異常,特別是血液中過高的膽固醇含量是引發(fā)這些疾病的主要因素之一。因此,控制高脂血癥的發(fā)生對于預(yù)防心腦血管疾病有著重要意義。苜蓿皂苷具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,降低機(jī)體膽固醇含量等作用,但是目前對其機(jī)理研究并不多,特別是細(xì)胞水平上的研究更少。為了研究苜蓿皂苷在細(xì)胞水平上對膽固醇代謝的作用,試驗一以大鼠BRL肝細(xì)胞為研究對象研究苜蓿皂苷對細(xì)胞膽固醇代謝相關(guān)基因的影響；試驗二構(gòu)建膽固醇代謝關(guān)鍵基因-低密度脂蛋白受體（LDLR）的串聯(lián)親和純化載體并在293T細(xì)胞中表達(dá)。具體情況如下：試驗一苜蓿皂苷對大鼠BRL肝細(xì)胞基因表達(dá)的影響。1、將培養(yǎng)2d的BRL正常細(xì)胞隨機(jī)分為4組,正常細(xì)胞對照A組、正常細(xì)胞+苜蓿皂苷50 mg/L B組、正常細(xì)胞+苜蓿皂苷100mg/LC組和正常細(xì)胞+苜蓿皂苷150mg/LD組。正常BRL細(xì)胞分組后培養(yǎng)24 h,加入不同濃度的苜蓿皂苷液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞,運用qRT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)LDLR、LXR（肝X受體）和FXR（膽汁酸受體）mRNA的表達(dá)。2、采用... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 苜蓿皂苷降低機(jī)體膽固醇的作用及其機(jī)理研究進(jìn)展
        1.1.1 苜蓿皂苷結(jié)構(gòu)
        1.1.2 苜蓿皂苷的理化特征
        1.1.3 苜蓿皂苷的主要生物學(xué)活性
            1.1.3.1 苜蓿皂苷具有溶血作用
            1.1.3.2 苜蓿皂苷具有增加免疫、抗氧化作用
            1.1.3.3 苜蓿皂苷具有抗菌消炎作用
            1.1.3.4 苜蓿皂苷具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,降低膽固醇的作用
            1.1.3.5 苜蓿皂苷的其它作用
            1.1.4 苜蓿皂苷降低機(jī)體膽固醇的分子機(jī)理研究
                1.1.4.1 苜蓿皂苷影響膽固醇的吸收和合成,減少機(jī)體膽固醇的來源
                1.1.4.2 苜蓿皂苷加速膽汁酸的排泄,影響肝腸循環(huán)
                1.1.4.3 苜蓿皂苷促進(jìn)LDL受體、非受體途徑的代謝
                1.1.4.4 苜蓿皂苷影響膽固醇的轉(zhuǎn)運
    1.2 低密度脂蛋白受體及其調(diào)節(jié)機(jī)制研究進(jìn)展
        1.2.1 LDLR的結(jié)構(gòu)和功能
        1.2.2 LDLR的調(diào)節(jié)機(jī)制
            1.2.2.1 LDLR的膽固醇依賴的調(diào)節(jié)機(jī)制
            1.2.2.2 LDLR的非膽固醇依賴的調(diào)節(jié)機(jī)制
        1.2.3 影響LDLR mRNA表達(dá)調(diào)控的因素
            1.2.3.1 HMG-CoA還原酶抑制劑
            1.2.3.2 激素
            1.2.3.3 膽固醇
            1.2.3.4 植物提取物
            1.2.3.5 其他因素
    1.3 展望
2 引言
3 試驗一 苜蓿皂苷對大鼠BRL肝細(xì)胞基因表達(dá)的影響
    3.1 材料與方法
        3.1.1 試驗材料
        3.1.2 主要試劑和儀器
        3.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)前的準(zhǔn)備工作
        3.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇
            3.1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代
            3.1.4.2 細(xì)胞凍存
            3.1.4.3 細(xì)胞復(fù)蘇
        3.1.5 細(xì)胞計數(shù)
        3.1.6 BRL大鼠肝細(xì)胞的培養(yǎng)
    3.2 指標(biāo)測定與方法
        3.2.1 MTT法測定苜蓿皂苷對大鼠BRL肝細(xì)胞活性的影響
            3.2.1.1 MTT溶液的配制
            3.2.1.2 細(xì)胞活性的測定方法
        3.2.2 mRNA相對表達(dá)量測定
            3.2.2.1 大鼠BRL肝細(xì)胞總RNA的提取
            3.2.2.2 RNA濃度的測定
            3.2.2.3 總RNA的質(zhì)量檢測
            3.2.2.4 RNA反轉(zhuǎn)錄過程
            3.2.2.5 引物設(shè)計與合成
            3.2.2.6 熒光定量PCR
            3.2.2.7 統(tǒng)計分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 MTT法檢測苜蓿皂苷對大鼠BRL肝細(xì)胞增殖活性的影響
        3.3.2 苜蓿皂苷對正常和脂變大鼠BRL肝細(xì)胞LDLR mRNA表達(dá)量的影響
        3.3.3 苜蓿皂苷對正常和脂變大鼠BRL肝細(xì)胞LXRα mRNA表達(dá)量的影響
        3.3.4 苜蓿皂苷對正常和脂變大鼠BRL肝細(xì)胞FXR mRNA表達(dá)量的影響
    3.4 討論
        3.4.1 MTT法檢測苜蓿皂苷對大鼠BRL肝細(xì)胞活性的影響
        3.4.2 苜蓿皂苷對大鼠BRL肝細(xì)胞LDLR mRNA表達(dá)量的影響
        3.4.3 苜蓿皂苷對大鼠BRL肝細(xì)胞LXRα mRNA表達(dá)量的影響
        3.4.4 苜蓿皂苷對大鼠BRL肝細(xì)胞FXR mRNA表達(dá)量的影響
    3.5 小結(jié)
4 試驗二 重組質(zhì)粒pNTAP-LDLR的構(gòu)建及表達(dá)
    4.1 材料與方法
        4.1.1 實驗材料
        4.1.2 主要試劑和儀器
        4.1.3 主要溶液的配制
    4.2 指標(biāo)測定與方法
        4.2.1 LDLR基因的擴(kuò)增和T-A克隆
            4.2.1.1 大鼠肝臟總RNA提取
            4.2.1.2 RNA濃度的測定：同試驗一
            4.2.1.3 總RNA的質(zhì)量檢測：同試驗一
            4.2.1.4 RNA反轉(zhuǎn)錄過程：同試驗一
            4.2.1.5 引物設(shè)計與合成
            4.2.1.6 LDLR片段的擴(kuò)增和純化回收
            4.2.1.7 LDLR基因T-A克隆
        4.2.2 重組載體的構(gòu)建和鑒定
            4.2.2.1 重組載體的構(gòu)建
            4.2.2.2 重組載體的酶切鑒定
        4.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T檢測目的蛋白表達(dá)
            4.2.3.1 293T細(xì)胞的培養(yǎng)
            4.2.3.3 Western blotting檢測LDLR蛋白的表達(dá)
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 總RNA提取
        4.3.2 LDLR基因擴(kuò)增
        4.3.3 PCR產(chǎn)物T-A克隆菌落PCR鑒定及測序鑒定
        4.3.4 pNTAP-LDLR串聯(lián)親和表達(dá)載體的構(gòu)建和酶切鑒定
        4.3.5 pNTAP-LDLR串聯(lián)親和表達(dá)載體測序鑒定
        4.3.6 Western blot檢測分析
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
5 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
英文摘要


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]苜蓿皂苷對高脂血癥大鼠膽固醇代謝及其相關(guān)基因表達(dá)的影響[J]. 王先科,史瑩華,王成章,陳明亮,袁德地.  動物營養(yǎng)學(xué)報. 2012(05)
[2]苜蓿皂苷對斷奶仔豬脂質(zhì)代謝、抗氧化和免疫的影響[J]. 王成章,王彥華,史瑩華,嚴(yán)學(xué)兵,何云,樊文娜.  草業(yè)學(xué)報. 2011(04)
[3]小檗堿對高脂血癥兔脂代謝及肝臟LDLR和SR-B1基因表達(dá)的影響[J]. 金磊,何琦,周岐新,楊俊霞.  中國生物制品學(xué)雜志. 2010(11)
[4]高膽固醇膳食對大鼠和倉鼠肝臟HMG-CoA-R、LDL-R蛋白和基因表達(dá)的影響[J]. 王浩,張澤生,張穎,溫生萍,左艷博,凌潔.  食品研究與開發(fā). 2010(10)
[5]苜蓿皂甙對斷奶仔豬生長性能和抗氧化性能的影響[J]. 史瑩華,王成章,徐兵,王先科,陳明亮,袁德地.  草地學(xué)報. 2010(05)
[6]三七總皂甙對脂肪變性L02肝細(xì)胞TG含量及LXRα mRNA表達(dá)的影響[J]. 程少冰,楊欽河,張玉佩,楊環(huán)文,謝芳,薛川松,歐健.  中國病理生理雜志. 2010(06)
[7]大豆異黃酮對去卵巢大鼠LXRα表達(dá)影響[J]. 張鋒,萬忠曉,張玉梅.  中國公共衛(wèi)生. 2010(02)
[8]苜蓿皂苷對斷奶仔豬生產(chǎn)性能、消化率及血液生化指標(biāo)的影響[J]. 王彥華,王成章,高永革,嚴(yán)學(xué)兵,史瑩華,何云.  草業(yè)學(xué)報. 2009(05)
[9]肝X受體的研究進(jìn)展[J]. 王強(qiáng),江渝.  生理科學(xué)進(jìn)展. 2009(02)
[10]低密度脂蛋白受體及其調(diào)節(jié)機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 張銳,張紹芬.  國外醫(yī)學(xué)(老年醫(yī)學(xué)分冊). 2009(01)

博士論文
[1]姜黃素對肝細(xì)胞LDLR表達(dá)作用的分子機(jī)理研究[D]. 竇曉兵.北京中醫(yī)藥大學(xué) 2007

碩士論文
[1]用TAP系統(tǒng)篩選與Pygopus-2相互作用蛋白的初步研究[D]. 張毓純.廈門大學(xué) 2008
[2]苜蓿皂甙在產(chǎn)蛋雞及蛋雛雞飼糧中的應(yīng)用研究[D]. 潘俊良.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[3]苜蓿皂甙和草粉對斷奶仔豬和肥育豬生產(chǎn)性能的影響及其機(jī)理研究[D]. 王彥華.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007



本文編號：3326328