豬瘟（Classical swine fever,CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一種疾病,它給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。多年來,許多政府和人們針對豬瘟病毒采取了多種清除措施,然而,這種疾病卻依然頑強(qiáng)的存在并肆虐著。這使得開發(fā)出更加有效的抗病策略來消滅CSFV變得十分必要和緊迫。本研究以豬胎兒成纖維細(xì)胞為研究對象,首先對CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的定點整合技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化和提高。接著,將抗病毒RNA干擾技術(shù)與CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的定點整合技術(shù)相結(jié)合成功的獲得了抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因豬。體內(nèi)及體外的病毒感染結(jié)果證實該轉(zhuǎn)基因豬對豬瘟病毒的復(fù)制和增殖具有一定的抑制能力,能顯著減少豬瘟病毒對豬群的致死率。除此之外,本研究還通過CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的定點突變技術(shù)探究了LamR基因定點突變對豬瘟病毒抵抗的影響,發(fā)現(xiàn)豬LamR基因的定點突變能夠是豬的細(xì)胞有效的抵御豬瘟病毒的感染,并成功地獲得了LamR基因精確點突變的基因編輯豬。綜上,本研究證實了通過基因工程的手段可以賦予豬體一定的病毒抵御能力,為后續(xù)抗病育種以及抗病毒研究提供... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：115 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

CRISPR/Cas9在豬基因組Rosa26基因的靶位示意圖

sgRNA 序列及對應(yīng) PAM 區(qū)序列如下表：靶基因的序列（5’—3’） PAM 區(qū)序列SgRNA91 GTGAGAGTTATCTGACCGTA AGGSgRNA89 CTTGGGCCTATGCTCAAGAT GGGSgRNA86 ATCTTGACTACCACTGCGAT TGG1.3.2 電轉(zhuǎn)染體系的優(yōu)化通過 BTX 公司的 ECM2001 電轉(zhuǎn)儀對 PFF 細(xì)胞的電轉(zhuǎn)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的目標(biāo)為該電轉(zhuǎn)儀的三個主要參數(shù)，即：電壓、脈沖長度、脈沖次數(shù)。通過將EGFP 表達(dá)質(zhì)粒按照不同的轉(zhuǎn)染參數(shù)的組合進(jìn)行電轉(zhuǎn)染實驗，并于轉(zhuǎn)染 48h 后，通過倒置熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀對 PFFs 的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行評估。最終，PFFs 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率提高至 96.45%，如圖 1.2

圖 1.3 多種細(xì)胞系的 EGFP 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)熒光圖；Fig1.3 The transfection efficiency of the pEGFP-N1 vector into the indicated cell lineswasanalysed via fluorescence microscopy.最后，本研究還證實了體外轉(zhuǎn)錄的 mRNA 及 siRNA 也可通過該電轉(zhuǎn)染體系實現(xiàn)高效的轉(zhuǎn)染，結(jié)果見圖 1.4。這些結(jié)果暗示了該電轉(zhuǎn)染體系的多能性，為后續(xù)不同細(xì)胞中基因功能的研究提供了保障。


本文編號：3319401