為進一步探究鵝卵泡顆粒細胞內(nèi)源性脂肪酸合成代謝機制,利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建靶向鵝硬脂酰輔酶A去飽和酶（stearoyl-coenzyme A desaturase, SCD）基因的慢病毒敲減質(zhì)粒并進行慢病毒包裝。首先設(shè)計鵝SCD基因的單鏈指導(dǎo)RNA（single-guide RNA, sgRNA）序列,其次體外合成并驗證裂解效率,最后利用psPAX2和pMD2.G包裝質(zhì)粒制備psgRNA-mCherry-T2A-Puro和pLenti-Cas9-T2A-EGFP慢病毒質(zhì)粒。結(jié)果表明,慢病毒質(zhì)粒被成功構(gòu)建,且其感染中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）細胞后篩選出能同時表達紅色熒光蛋白和增強綠色熒光蛋白的強雙陽性細胞群。這為后續(xù)感染鵝原代顆粒細胞并敲減其SCD基因研究奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：浙江大學學報(農(nóng)業(yè)與生命科學版). 2020,46(05)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

鵝SCD基因sg RNA靶點設(shè)計示意圖

圖1 鵝SCD基因sg RNA靶點設(shè)計示意圖2.3 psg RNA-m Cherry-T2A-Puro和p Lenti-Cas9-T2A-EGFP病毒感染CHO細胞分析

將感染后的CHO細胞擴繁消化，在BD FACSAriaⅡ流式細胞分析儀上分析細胞的熒光比例與強度。由圖5可知，psg RNA1-m Cherry-T2A-Puro和p Lenti-Cas9-T2A-EGFP共同感染效率為13.4%,psg RNA3-m Cherry-T2A-Puro和p Lenti-Cas9-T2A-EGFP共同感染效率為11.2%,psg RNANC-m Cherry-T2A-Puro和p Lenti-Cas9-T2A-EGFP共同感染效率為16.6%。利用分選儀器，分別篩選出強雙陽性細胞群，并接種至24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，篩選后的細胞能同時表達紅色熒光蛋白和增強綠色熒光蛋白（圖6）。3 討論


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