為建立快速同步檢測雞源新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒與傳染性支氣管炎病毒的多重RT-PCR檢測方法,并應用于臨床檢測。參考GenBank中NDV NP、 IBV N和IBDV VP基因序列,設計了3對特異性引物。通過優(yōu)化引物濃度及退火溫度建立多重RT-PCR方法,并進行特異性、敏感性和重復性試驗。結果顯示,成功建立了檢測NDV、 IBDV和IBV的三重RT-PCR方法,具有良好的特異性和穩(wěn)定性,只擴增出NDV、 IBDV和IBV的特異性片段,對雞大腸桿菌、雞沙門氏菌、雞巴氏桿菌和雞馬立克等其他無關病原核酸無擴增;對NDV、 IBDV和IBV核酸最低檢測量分別為NDV6.18×10¹copies/μl、 IBDV 8.64×10⁶copies/μl和IBV2.57×10²copies/μl;用該方法進行多次重復性試驗結果一致。結果表明,所建立方法對NDV、 IBDV和IBV的三重RT-PCR方法特異性強、敏感性高、重復性好;為雞源新城疫、染性法氏囊與傳染性支氣管炎臨床混合感染病例的診斷和流行病學調(diào)查提供了可靠的方法。 

【文章來源】：中國畜禽種業(yè). 2020,16(11)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

NDV退火溫度優(yōu)化

IBV退火溫度優(yōu)化

本研究參考Gen Bank中雞新城疫、傳染性法氏囊和傳染性支氣管炎相應靶基因的保守序列設計特異性引物。選擇新城疫NP基因，傳染性法氏囊VP基因，傳染性支氣管炎N基因作為靶序列，應用Primer Premier5.0分別設計3對特異性引物，通過NCBI BLAST比對和DNAStar軟件分析確保不同引物對之間沒有同源關系，不會形成穩(wěn)定的引物二聚體。分別設計3個目的片段為144bp、429bp、600bp,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后大小之差約在200bp左右，使目的片段分布在Marker不同標尺大小的區(qū)域，具有辨識度，不易造成誤判[21]。多重PCR技術的反應體系較常規(guī)PCR有較高的要求，們在對本研究中的每種待檢病毒進行普通PCR檢測成功的基礎上，通過不斷優(yōu)化反應體系及反應程序中的退火溫度，確保每一重的擴增效率保持一致，以降低引物二聚體甚至多聚體的形成。且在試驗過程中選取了沙門氏菌核酸、大腸桿菌核酸、禽白血病病毒核酸以及禽支原體核酸進行特異性檢測，結果均未檢出這幾類常見禽類病原核酸，證實了本試驗建立的m PCR具有較好的特異性。同時本研究在單一RT-PCR檢測方法的基礎上，建立了一步法多重RT-PCR，在一個反應體系中進行反轉(zhuǎn)錄（RT）與聚合酶鏈式反應（PCR），節(jié)省了時間和操作步驟，大大提高了病原檢測的效率。在本研究中，不僅可以從組織器官、排泄物、鼻腔拭子以及細胞培養(yǎng)物等臨床樣本中提取到病毒總RNA，還可以直接從血清、全血等血液樣本中提取出病毒總RNA。本研究建立的一步法多重RT-PCR方法特異性強，敏感性比較高，其最低RNA檢測下限達到了NDV6.18×101copies/μl、IBDV8.64×106copies/μl和IBV2.57×102copies/μl，可以用來檢測血清中含量較低的NDV、IBDV和IBV，因此，本方法可以用于血清病原篩查，可應用于臨床大樣本量的快速檢測。圖5 NDV、IBDV和IBV三重RT-PCR特異性優(yōu)化

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3288824