隨著對FMDV研究深入，有學者發(fā)現(xiàn)在FMDV基因組中可以表達外源基因片段。通過對FMDV的基因組進行突變和插入，而達到獲得新型產(chǎn)品用于應用的目的。本實驗目的在于構(gòu)建一株含有標記的口蹄疫疫苗候選株用于區(qū)分野毒感染與疫苗免疫。為了制備一個抗原表位缺失的口蹄疫標記疫苗株，以含有Asia1型口蹄疫病毒cDNA全長的感染性克隆pAsia1-FMDV作為框架，將3D蛋白的抗原決定簇進行突變。選取3D蛋白中的第27位氨基酸的組氨酸和31位的氨基酸天冬酰胺進行突變，將其分別突變?yōu)槔野彼崤c精氨酸。把該抗原表位突變，從而導致該表位不能與對應單抗結(jié)合，繼而獲得口蹄疫抗原表位缺失毒株，也稱之為負標記毒株。將含有負標記的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后，能夠觀察到明顯的細胞病變效應（CPEs），通過RT-PCR和間接免疫熒光試驗，表明重組的FMDV被成功拯救出。在對重組FMDV的生物學特性與親本毒株比較后發(fā)現(xiàn)，重組病毒的生物學特性與親本毒株相似。當重組病毒感染動物后，動物能夠迅速的產(chǎn)生特異性的抗病毒抗體，利用間接免疫熒光反應能夠在細胞上檢測到病毒蛋白。依照重組病毒和親本毒株的3D蛋白氨基酸序列分別合成了兩條長度為... 

【文章來源】：甘肅農(nóng)業(yè)大學甘肅省

【文章頁數(shù)】：45 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

構(gòu)建質(zhì)粒簡圖

甘肅農(nóng)業(yè)大學 2014 屆碩士學位論文5圖1-2 嵌合VPg的構(gòu)建簡圖[27]Fig. 1-2 Schematic representation of the constructions with one copy of VPgs[27].FMDV容易變異，這對FMD的防控十分不利，所以要將FMDV作為載體，穩(wěn)定的弱毒株是關(guān)鍵。目前許多學者都在嘗試將FMDV弱化，不僅能夠作為載體，如果毒株穩(wěn)定性強可以直接制成弱毒苗疫苗。弱化FMDV是未來研究的一個熱點方向。如L蛋白的SAP結(jié)構(gòu)突變毒株，發(fā)現(xiàn)感染動物后無臨床癥狀也沒有排毒帶毒現(xiàn)象，并能產(chǎn)生有保護性的抗體[3,32-33]。目前我們實驗室利用反向遺傳技術(shù)已經(jīng)成功構(gòu)建了病毒滴度高、抗原匹配性好、免疫保護力強的疫苗株[34]。Seago等[18]的研究為FMDV表達大的外源片段方面帶來了新的突破。因此FMDV基因組承載外源片段的能力也是FMDV研究的又一重點。國內(nèi)外一直致力于FMDV的研究，其目的旨在有效控制FMD的流行。通過引入外源基因?qū)MDV進行改造可以解決很多現(xiàn)階段FMD防控的問題。如：我國控制FMD的主要手段是通過免疫滅活疫苗

2.1 重組質(zhì)粒的擴增和鑒定使用引物3DF與3DR擴增目片段，目的片段大小合適，電泳結(jié)果見圖2-1。獲得的陽性質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，酶切結(jié)果與預期相符，結(jié)果如圖2-2。圖2-1 ：3D蛋白編碼區(qū)擴增Fig.2-1: Amplification of 3D protein coding regions圖2-2 重組質(zhì)粒prAsia1-3DM酶切鑒定Fig2-2: Identification of genetically engineered recombinant plasmidprAsia1-3DM by enzymatic digestionM ．DL5000 DNA marker 1. prAsia1-FM DV; 2. pAsia1-FM DV.

【參考文獻】：
期刊論文
[1]口蹄疫病毒基因組的遺傳變異剖析[J]. 陳豪泰,張杰,孫德惠,馬麗娜,劉湘濤,劉永生.  中國農(nóng)業(yè)科學. 2008(09)



本文編號：3262921