肺炎克雷伯氏菌是一種條件致病菌，過去人們認為對畜禽危害不大，一直未引起重視。但是近年來關于肺炎克雷伯氏菌引起毛皮動物疾病的報道卻在迅速增加，加之各種抗菌藥物的廣泛使用，導致該菌的耐藥性增強，多重耐藥菌株的出現(xiàn)，肺炎克雷伯氏菌病在毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)中危害越來越嚴重，因此隨著環(huán)境的改變，肺炎克雷伯氏菌作為人畜共患傳染病的病原，應引起廣泛的重視。本研究對肺炎克雷伯氏菌在傳統(tǒng)的理化特性鑒定基礎上，又對12株不同動物來源的代表性菌株進行了23S rRNA基因序列的分析、構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，比較各菌種屬間的差異，為肺炎克雷伯氏菌在分子水平的系統(tǒng)學研究和遺傳多樣性研究奠定基礎，建立了一種快速、簡便的肺炎克雷伯氏菌的鑒定方法和23S rRNA基因序列分析方法。由于目前市場上尚沒有有效的肺炎克雷伯氏菌疫苗用于該病的防治，致使該病得不到合理有效的防治，嚴重制約著毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。因此本研究分別以泰山松花粉多糖、蜂膠等為佐劑，利用微膠囊技術制備了肺炎克雷伯氏菌微膠囊疫苗，并口服免疫小白鼠，檢測免疫指標，對于肺炎克雷伯氏菌的防治具有重要意義，同時為新型口服疫苗和控釋制劑的開發(fā)奠定了基礎。1.山東部分地區(qū)毛皮動物肺... 

【文章來源】：山東農業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

SrRNA可變區(qū)位點結構

該分離菌在血液平板上均呈圓形、隆起、濕潤、閃光、邊緣整齊、灰白色、不透明、易融合、黏稠、接種環(huán)挑起易拉成長絲、生長豐盛的奶油狀菌落，其在血液平板上有β型溶血暈。8株分離菌革蘭氏染色為陰性，粗短桿菌（圖2），單個、成對或個別短鏈狀排列，無鞭毛、有莢膜，菌體大小約為0.3-1.5 μm×0.6-6.0 μm。圖2 分離菌株菌落形態(tài)及鏡檢結果Fig.2 Colony characteristics and morphology after Gram stainingA：分離菌株菌落形態(tài)；B：分離菌株鏡檢結果A: Colony characteristics of the bacteria isolates; B: morphology after Gram staining the bacteria isolates3.1.3 生化鑒定結果將不同地區(qū)分離率最高的8株有代表性的疑似肺炎克雷伯氏菌分別通過細菌生化試驗（微量發(fā)酵管）和ATB Expression半自動細菌鑒定儀進行鑒定，8株分離菌的生化特性一致，生化試驗結果見表3。表3 分離菌株的生化鑒定結果Table3 Physiological and biochemical characteristics of the bacteria isolates生化項目Detection結果Result生化項目Detection結果Result生化項目Detection結果Result生化項目Detection結果Result生化項目Detection結果Result山梨糖 + 肌醇 + 密二糖 + 枸櫞酸鹽 + 葡萄糖 +棉子糖 + 山梨醇 + 丙二酸鹽 + 硫化氫 - 血清菊糖 -蔗糖 + 側金盞花醇 + 賴氨酸 + 尿素 + 鼠李糖 +麥芽糖 + 甘露醇 + 纖維二糖 + 七葉苷 + 阿拉伯糖 +木糖 + 衛(wèi)矛醇 - 硝酸鹽還原 + 0/F 發(fā)酵 + MR -乳糖 + 氰化鉀 + β-半乳糖 + ONPG + VP +注:“+”為陽性反應,“-”為陰性反應Note: “+”stands for positive; “-”stands for negative

33圖3 小鼠剖檢病變結果Fig.3 Necropsy lesions of mouseA：肝臟出血點；B：肝臟壞死A: Haemorrhage nod of liver; B: Necrosis of liver3.1.6 16S rRNA 基因序列與系統(tǒng)發(fā)育分析提取以上8株分離菌的基因組，對其16S rRNA擴增,在423 bp處有目的片段，與預期擴增結果一致（圖4）。將8株分離菌株所測序列與GenBank收錄的肺炎克雷伯氏菌菌株通過DNAStar進行同源性分析，并繪制成系統(tǒng)進化樹（圖5）。8株分離菌株核苷酸序列之間同源性為99.1%-99.8%，與AY9963633株肺炎克雷伯氏菌（中國河北）核苷酸序列同源性為99.3%-100%，與AB675600株肺炎克雷伯氏菌（日本）核苷酸序列同源性為98.6%-99.1%（圖6），結果顯示本研究分離的8株分離菌與國內菌株同源性更近。圖4 8株分離菌16S rRNA目的基因的PCR結果Fig

【參考文獻】：
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博士論文
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本文編號：3250537