木聚糖是半纖維素的主要組成成分,而半纖維素廣泛存在于植物細胞壁中,是自然界中含量僅次于纖維素的可再生資源。多種谷物飼料如小麥、大麥、燕麥等含有較多的木聚糖,影響了營養(yǎng)物質的利用與吸收,因此選擇合適的木聚糖酶來降解木聚糖就十分必要。微生物產生的天然木聚糖酶酶多為混合酶,其產量和酶活較低制約了木聚糖酶的工業(yè)化生產和應用,采用基因工程技術獲得活力好、產量高、性質穩(wěn)定的木聚糖酶資源成為研究的熱點。本試驗采用RT-PCR技術擴增目的基因,將目的基因片段克隆到PMD19-T載體上,經測序檢測后,與GenBank中已公布木聚糖酶基因序列對比發(fā)現(xiàn),該木聚糖酶基因與已公布序列（黑曲霉Aspergillus niger C71（JF693944.1））的同源性高達100%,該基因的編碼區(qū)不含信號肽序列,不含內含子序列,推測編碼225個氨基酸,蛋白分子量約為24.13 kDa,蛋白等電點約為5.23。構建真核表達載體后,將其電擊轉化、篩選和鑒定,最終證實pGAPZaA-木聚糖酶基因重組質粒載體已成功整合入畢赤酵母中,重組酵母可分泌與預期目的蛋白大小相當?shù)拿傅鞍讞l帶,證實了木聚糖酶基因在畢赤酵母中得到了成功表... 

【文章來源】：河南農業(yè)大學河南省

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
第一章 文獻綜述
    1.1 NSP、木聚糖及其降解酶
        1.1.1 NSP與木聚糖
        1.1.2 木聚糖的抗營養(yǎng)特性
        1.1.3 木聚糖酶及其分類
    1.2 木聚糖酶基因的研究進展
        1.2.1 木聚糖酶基因的克隆
            1.2.1.1 木聚糖酶基因的克隆方法
            1.2.1.2 陽性克隆子的檢測方法
            1.2.1.3 克隆的木聚糖酶基因
        1.2.2 木聚糖酶基因的表達體系
            1.2.2.1 細菌表達體系
            1.2.2.2 真菌表達體系
    1.3 畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)越性
    1.4 易錯PCR技術
    1.5 木聚糖酶的應用
        1.5.1 木聚糖酶在造紙行業(yè)的應用
        1.5.2 木聚糖酶在飼料行業(yè)的應用
        1.5.3 木聚糖酶在食品行業(yè)的應用
        1.5.4 木聚糖酶的其他應用
    1.6 研究目的及意義
第二章 木聚糖酶基因的克隆及鑒定
    2.1 試驗材料
        2.1.1 試驗儀器
        2.1.2 試驗菌種與質粒
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 培養(yǎng)基和溶液
    2.2 試驗方法
        2.2.1 引物設計
        2.2.2 目的基因的獲取
            2.2.2.1 黑曲霉(Aspergillus niger)的培養(yǎng)
            2.2.2.2 黑曲霉總RNA的提取
            2.2.2.3 去除黑曲霉總RNA樣品中的基因組DNA
            2.2.2.4 RT-PCR
        2.2.3 RT-PCR產物的純化與回收
        2.2.4 RT-PCR產物與PMD19-T載體的連接
        2.2.5 連接產物的轉化
        2.2.6 陽性克隆子的篩選與鑒定
            2.2.6.1 藍白斑篩選
            2.2.6.2 菌落PCR鑒定
            2.2.6.3 重組質粒的提取及檢測
    2.3 結果與分析
        2.3.1 黑曲霉木聚糖酶基因組總RNA的提取結果
        2.3.2 黑曲霉木聚糖酶基因RT-PCR的擴增結果
        2.3.3 重組克隆子的藍白斑篩選結果
        2.3.4 重組克隆子的鑒定
            2.3.4.1 重組克隆子菌落PCR擴增結果
            2.3.4.2 重組克隆子質粒提取及雙酶切鑒定結果
            2.3.4.3 重組克隆子質粒檢測結果
    2.4 討論
    2.5 小結
第三章 木聚糖酶基因真核表達載體電擊轉化至畢赤酵母
    3.1 試驗材料
        3.1.1 試驗儀器
        3.1.2 試驗菌種與質粒
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 表達質粒pGAPZαA的圖譜
        3.1.5 培養(yǎng)基與溶液
            3.1.5.1 培養(yǎng)基的配制
            3.1.5.2 溶液的配制
    3.2 試驗方法
        3.2.1 術聚糖酶基因真核表達載體的構建
            3.2.1.1 黑曲霉木聚糖酶基因的純化與回收
            3.2.1.2 真核表達載體pGAPZαA的純化與回收
            3.2.1.3 木聚糖酶基因和真核表達載體pGAPZαA質粒的連接
            3.2.1.4 連接產物轉化至大腸桿菌
            3.2.1.5 重組克隆子的篩選與鑒定
        3.2.2 重組pGAPZαA-木聚糖酶基因質粒的電擊轉化
            3.2.2.1 重組pGAPZαA-木聚糖酶基因質粒的線性化
            3.2.2.2 畢赤酵母感受態(tài)細胞的制備
            3.2.2.3 電擊轉化
            3.2.2.4 重組酵母菌的鑒定
    3.3 結果與分析
        3.3.1 木聚糖酶基因真核表達載體的構建結果
            3.3.1.1 重組克隆子的平板篩選結果
            3.3.1.2 重組表達載體pGAPZαA-木聚糖酶基因的鑒定
        3.3.2 重組酵母菌的鑒定
            3.3.2.1 重組酵母菌的抗性篩選結果
            3.3.2.2 重組畢赤酵母菌的菌落PCR鑒定結果
            3.3.2.3 SDS-PAGE蛋白電泳檢測結果
    3.4 討論
    3.5 小結
第四章 重組畢赤酵母產酶活性的檢測
    4.1 試驗材料
        4.1.1 試驗儀器
        4.1.2 試驗菌種
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 培養(yǎng)基與溶液
            4.1.4.1 培養(yǎng)基配制
            4.1.4.2 溶液的配制
    4.2 試驗方法
        4.2.1 重組酵母菌平板檢測結果
        4.2.2 木聚糖酶活力的檢測方法
            4.2.2.1 木糖標準曲線的測定
            4.2.2.2 木聚糖酶活力的測定方法
        4.2.3 不同碳源對重組酵母產酶活力的測定
            4.2.3.1 粗酶液的制備
            4.2.3.2 木聚糖酶活力的檢測
        4.2.4 不同重組酵母的產酶活力的測定
    4.3 結果與分析
        4.3.1 重組酵母菌平板檢測結果
        4.3.2 木糖標準曲線
        4.3.3 不同碳源對重組酵母菌木聚糖酶活性的影響
        4.3.4 不同重組酵母菌產酶活力的測定結果
    4.4 討論
    4.5 小結
第五章 利用易錯PCR改變木聚糖酶基因
    5.1 試驗材料
    5.2 試驗方法
        5.2.1 引物設計
        5.2.2 木聚糖酶基因易錯PCR擴增、轉化及鑒定方法
            5.2.2.1 質粒PCR擴增及產物的純化與回收
            5.2.2.2 易錯PCR擴增及產物的純化與回收
            5.2.2.3 突變基因的克隆與篩選
        5.2.3 重組表達質粒的構建與轉化
    5.3 結果與分析
        5.3.1 易錯PCR擴增結果
            5.3.1.1 質粒PCR擴增及易錯PCR擴增結果
            5.3.1.2 重組克隆子的藍白斑篩選結果
            5.3.1.3 重組克隆子的鑒定
        5.3.2 木聚糖酶突變基因真核表達載體的構建結果
            5.3.2.1 重組克隆子的平板篩選結果
            5.3.2.2 重組表達載體pGAPZαA-木聚糖酶突變體基因的鑒定
        5.3.3 重組酵母菌的鑒定
            5.3.3.1 重組酵母菌的抗性篩選結果
            5.3.3.2 重組酵母的PCR鑒定結果
            5.3.3.3 SDS-PAGE蛋白電泳檢測結果
    5.4 討論
    5.5 小結
第六章 突變株和原始基因重組酵母產酶活性及酶學性質的分析
    6.1 試驗材料
        6.1.1 試驗儀器
        6.1.2 試驗菌種
        6.1.3 主要試劑及培養(yǎng)基
    6.2 試驗方法
        6.2.1 不同重組酵母菌產酶活力的測定方法
            6.2.1.1 粗酶液的制備
            6.2.1.2 木聚糖酶活力的測定
        6.2.2 培養(yǎng)時間對重組酵母產酶活力影響
        6.2.3 木聚糖酶酶學性質的分析
            6.2.3.1 不同溫度處理對木聚糖酶活力的影響
            6.2.3.2 不同pH處理對木聚糖酶活力的影響
        6.2.4 添加0.2%的Tween80對木聚糖酶活力的影響
        6.2.5 木聚糖酶對小麥中非淀粉多糖的降解
            6.2.5.1 色譜條件
            6.2.5.2 小麥的處理
            6.2.5.3 粗酶液的制備
    6.3 結果與分析
        6.3.1 不同突變株產酶活力的測定結果
        6.3.2 培養(yǎng)時間對重組酵母產酶活力的影響
        6.3.3 不同溫度處理對木聚糖酶活力的影響
        6.3.4 不同pH處理對木聚糖酶活力的影響
        6.3.5 添加0.2%的Tween80對木聚糖酶活力的影響
        6.3.6 木聚糖酶對小麥中非淀粉多糖的降解結果
    6.4 討論
    6.5 小結
總結
參考文獻
Abstract


【參考文獻】：
期刊論文
[1]黑曲霉木聚糖酶基因xynB的克隆及在釀酒酵母中的表達[J]. 張水龍,陳東,曹樹威,吳仁智,黃日波.  廣西科學. 2013(02)
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[3]基于易錯PCR的黃曲霉毒素解毒酶體外分子定向進化[J]. 張賽,邢克克,胡亞冬,謝春芳,劉大嶺,姚冬生.  生物工程學報. 2011(07)
[4]麥芽糖誘導耐堿性木聚糖酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達[J]. 張云雁,楊明明,周煌凱,段春燕,龔月生.  西北農業(yè)學報. 2011(01)
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[6]黑曲霉木聚糖酶基因（xynB）的克隆及真核分泌表達[J]. 張茂,周慶豐,杜云平,劉德武,孟繁明,周美華,吳珍芳.  農業(yè)生物技術學報. 2010(02)
[7]極端耐熱木聚糖酶基因在枯草芽孢桿菌中的整合表達[J]. 張偉,李冠,婁愷.  生物技術. 2010(01)
[8]不同類型日糧添加酶制劑對蛋品質和蛋鴨生產性能的影響[J]. 王景成,楊維仁,楊在賓,丁永敏,姜淑貞,張桂國.  中國糧油學報. 2009(01)
[9]不同比例小麥日糧添加木聚糖酶對肉雞生產性能的影響[J]. 鮑淑青,王敏,杜紅方,周鎮(zhèn)鋒.  飼料工業(yè). 2008(22)
[10]木聚糖酶XynⅡ的D37N突變、表達及酶學性質變化[J]. 周晨妍,李東峰,鄔敏辰,王武.  生物加工過程. 2008(03)

碩士論文
[1]木聚糖酶基因工程菌G81的構建及酶學性質研究[D]. 宋東鎣.河南師范大學 2010
[2]葡萄糖氧化酶的體外定向進化[D]. 劉丹.中國科學院研究生院（武漢病毒研究所） 2007
[3]木聚糖酶對小麥日糧非淀粉多糖降解規(guī)律及其對肉仔雞腸道組織形態(tài)的影響研究[D]. 雷麗.南京農業(yè)大學 2007



本文編號：3222120