提高家畜產(chǎn)肉性能,培育高產(chǎn)優(yōu)質的肉用家畜新品種是育種工作的目標之一,通過基因編輯技術可以快速改變特定基因組成,獲得需要的優(yōu)良性狀。MSTN基因為骨骼肌生長的負調控因子,該基因的突變會導致動物肌肉發(fā)達、體重增加；fat-1基因編碼ω-3多不飽和脂肪酸脫氫酶,可以將多不飽和脂肪酸從ω-6轉化為ω-3形式,fat-1基因的增加有利于提高動物體內ω-3的含量。本研究利用最新的CRISPR/Cas9基因編輯技術構建了敲除山羊MSTN基因的同時在該位點插入fat-1基因的gRNA載體和fat-1基因定點敲入載體,利用電轉法將載體轉入絨山羊胎兒成纖維細胞中,篩選陽性單克隆細胞,通過體細胞克隆的方法生產(chǎn)轉基因絨山羊,期望培育出在提高羊肉產(chǎn)量的同時增加羊肉中ω-3含量的家畜新品種。1、載體的構建本實驗成功構建了2對基于MSTN基因一號外顯子的gRNA表達載體,通過Survery酶切突變檢測gRNA2突變效率高于gRNA1;同時成功構建了含有fat-1外源基因且可以定點整合至宿主基因組MSTN位點的敲入載體5’h-pCAGD NA3-fat-1-3’h。2、轉基因單克隆細胞系的篩選本實驗使用電轉法將線性化... 

【文章來源】：內蒙古大學內蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一部分：實驗部分
    第一章：載體的構建
        1 材料
            1.1 主要儀器設備
            1.2 實驗材料和試劑
        2 方法
            2.1 CRISPR/Cas9表達載體的構建和效率檢測
            2.2 敲入載體fat-1(5’h-pCAGDNA3-fat-1-3’h)的構建
        3 結果
            3.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)化和sgRNA表達載體的構建
            3.2 Surveyor突變檢測結果
            3.3 敲入載體fat-1(5’h-pCAGDNA3-fat-1-3’h)的構建
        4. 討論
            4.1 CRISPR/Cas9介導的基因編輯
            4.2 敲入載體5’h-pCAGDNA3-fat-1-3’h載體的構建
        參考文獻
    第二章 CRISPR/Cas9介導的MSTN基因敲除同時定點整合外源基因fat-1單克隆細胞的篩選
        1. 材料
            1.1 主要儀器設備
            1.2 化學試劑與耗材
            1.3 實驗材料
        2 方法
            2.1 電穿孔法轉染GEFs
            2.2 單克隆細胞系的挑選
            2.3 基因修飾細胞系的鑒定
        3 結果
            3.1 轉基因單克隆細胞系的篩選
            3.2 轉基因細胞的鑒定
        4 討論
        參考文獻
    第三章 核移植技術制備轉基因阿爾巴斯絨山羊
        1 材料
            1.1 化學試劑與實驗材料
            1.2 主要儀器設備
        2 方法
            2.1 供體細胞的制備
            2.2 受體卵母細胞的收集和體外成熟培養(yǎng)
            2.3 卵子去核和體細胞核移植
            2.4 體細胞和去核卵母細胞的融合
            2.5 重構胚的激活
            2.6 重構胚胎的體外培養(yǎng)
            2.7 克隆胚胎移植
            2.8 妊娠檢查
            2.9 轉基因羊的接產(chǎn)
        3 結果
            3.1 供體細胞的制備
            3.2 卵母細胞的采集與成熟培養(yǎng)
            3.3 重構胚的構建及融合
            3.4 重構胚的體外培養(yǎng)及移植
            3.5 克隆胚胎移植及妊娠檢查
            3.6 轉基因羊的接產(chǎn)及鑒定
        4 討論
        參考文獻
    結論
第二部分 綜述部分
    1 CRISPR/Cas技術概述
        1.1 CRISPR/Cas的研究歷史
        1.2 CRISPR/Cas的結構
        1.3 CRISPR/Cas9技術介導基因組靶向修飾的作用機理
    2 CRISPR/Cas9技術在哺乳動物轉基因中的應用
        2.1 CRISPR/Cas9技術在制備轉基因敲除動物中的應用
        2.2 CRISPR/Cas9技術在制備轉基因敲入動物中的應用
        2.3 CRISPR/Cas9技術在制備轉基因動物時的優(yōu)、缺點
    3 展望
    參考文獻
附錄
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3220501