旨在采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）和橫向流動(dòng)試紙條（LFD）相結(jié)合的方法,建立一種快速、特異,過(guò)程可視化的豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）檢測(cè)方法。針對(duì)豬肺炎支原體（Mhp）P36基因設(shè)計(jì)5套特異性引物和1條異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的探針,進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。將生物素標(biāo)記的LAMP產(chǎn)物與FITC標(biāo)記的探針進(jìn)行特異性雜交,并使用橫向流動(dòng)試紙條完成擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。經(jīng)優(yōu)化,LAMP最佳反應(yīng)條件為65℃,反應(yīng)15 min,從基因組DNA提取到LFD結(jié)果判斷只需40 min左右,比常規(guī)PCR技術(shù)縮短近2 h。LAMP-LFD可特異性地檢出豬肺炎支原體（Mhp）,對(duì)豬鼻支原體（Mhr）及豬圓環(huán)病毒（PCV）等常見豬病病原的檢測(cè)結(jié)果為陰性。靈敏性試驗(yàn)表明,LAMP-LFD對(duì)Mhp的檢測(cè)靈敏度為1×10⁰個(gè)拷貝DNA,是普通PCR的1 000倍。利用本方法可從采集的88份臨床疑似病料樣品中檢測(cè)到64份陽(yáng)性,國(guó)標(biāo)PCR方法可檢測(cè)到56份陽(yáng)性,符合率可達(dá)90.9%。綜上,本研究建立的LAMP-LFD方法可特異、準(zhǔn)確地應(yīng)用于Mhp的檢測(cè),... 

【文章來(lái)源】：畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,51(06)北大核心CSCD

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LAMP-LFD特異性檢測(cè)結(jié)果

以Mhp基因組DNA為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物分別用瓊脂糖凝膠電泳、SYBR Green Ⅰ、LFD進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證該方法的可行性。結(jié)果顯示,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳,陽(yáng)性出現(xiàn)明顯的階梯狀條帶,而陰性對(duì)照無(wú)條帶(圖5A);SYBR Green Ⅰ通過(guò)肉眼可見陽(yáng)性顯現(xiàn)黃綠色,而陰性為橘黃色,在紫外分析儀下,陽(yáng)性發(fā)出強(qiáng)烈的黃綠色熒光,而陰性呈現(xiàn)橘色(圖5B);LFD顯示,陽(yáng)性在檢測(cè)線和控制線區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)2條紅線,而陰性僅在控制線出現(xiàn)1條紅線(圖5C)。因此,LAMP-LFD檢測(cè)方法可行。圖2 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]快速直接PCR檢測(cè)豬肺炎支原體方法的建立及其應(yīng)用[J]. 徐引弟,張青嫻,王治方,焦文強(qiáng),李海利,朱文豪,王克領(lǐng).  養(yǎng)豬. 2019(06)
[2]豬支原體肺炎臨床診斷及綜合防治[J]. 趙國(guó)勝.  畜牧獸醫(yī)科學(xué)(電子版). 2019(16)
[3]一起豬支原體肺炎的診斷與防治[J]. 許立陽(yáng).  當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè). 2019(07)
[4]豬支原體肺炎診斷及防治[J]. 劉建民.  畜牧獸醫(yī)科學(xué)(電子版). 2019(11)
[5]豬支原體肺炎診斷與防治措施[J]. 劉金媛.  畜牧獸醫(yī)科學(xué)(電子版). 2019(07)
[6]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增聯(lián)合橫向流動(dòng)試紙條檢測(cè)簡(jiǎn)單異尖線蟲/派氏異尖線蟲方法的建立[J]. 喬艷,周前進(jìn),李孝軍,苗亮,陳炯.  海洋與湖沼. 2019(02)
[7]綿羊肺炎支原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增聯(lián)合橫向流動(dòng)試紙條可視化檢測(cè)方法的建立[J]. 張潔,曹軍軍,祝明松,楊亞軍,吳文星,王璐,石峰.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2019(03)
[8]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與橫向流動(dòng)試紙條法快速檢測(cè)雞貧血病毒的研究[J]. 李秀梅,石瑜,朱雅寧,袁雪濤,楊愛(ài)華,楊穎.  中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào). 2018(01)
[9]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與橫向流動(dòng)試紙條法快速檢測(cè)布魯氏桿菌[J]. 李秀梅,梁智選,李穎,郭戀,王健春,趙靜,王紅軍.  食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2017(12)
[10]不同豬支原體肺炎活疫苗菌株P(guān)46和P97基因序列差異性分析[J]. 武昱孜,邢憲平,韋艷娜,熊祺琰,馮志新,邵國(guó)青.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2017(12)



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