豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）、豬輪狀病毒（PRoV）是仔豬常見的重要病毒性腹瀉病原,臨床上均以嘔吐、厭食、腹瀉、脫水為主要特征,仔豬的發(fā)病率和死亡率較高,給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。尤其是PEDV變異株,是近年來仔豬腹瀉的主要病原。由于臨床癥狀極其相似,難以區(qū)分,只能借助實驗室手段加以鑒別診斷。建立PEDV、TGEV、PDCoV及PRoV快速鑒別檢測方法,開展PEDV分子流行病學(xué)研究,對仔豬病毒性腹瀉的診斷和防控具有重要意義。1.PEDV、TGEV、PDCoV及PRoV多重RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用為鑒別檢測PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,本研究分別針對PEDV N基因、TGEVM基因、PDCoVN基因和PRoVVP6基因設(shè)計特異性引物,經(jīng)過優(yōu)化反應(yīng)條件,建立了同時檢測并區(qū)分4種病毒的多重RT-PCR方法。結(jié)果,該方法僅特異性擴增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,與豬其他主要病毒無交叉反應(yīng),具有很強的特異性;對PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的最低檢出下限分別為1.57×10²

【文章來源】：廣西大學(xué)廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：97 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1. 綜述
    1.1 豬流行性腹瀉病毒概述
        1.1.1 PEDV流行病學(xué)
        1.1.2 PEDV基本特征
        1.1.3 PEDV基因組結(jié)構(gòu)與功能
        1.1.4 PEDV主要編碼蛋白及其功能
    1.2 豬傳染性胃腸炎病毒概述
    1.3 豬輪狀病毒概述
    1.4 豬Delta冠狀病毒概述
    1.5 PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV檢測技術(shù)及其研究進展
        1.5.1 免疫熒光法(IF)
        1.5.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)
        1.5.3 免疫組織化學(xué)(IHC)
        1.5.4 病毒分離鑒定
        1.5.5 膠體金免疫層析技術(shù)
        1.5.6 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)
        1.5.7 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)
        1.5.8 熒光定量PCR檢測法
    1.6 研究目的及意義
    1.7 技術(shù)路線
2. PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用
    2.1 試驗材料
        2.1.1 病毒株
        2.1.2 主要試劑及儀器
    2.2 試驗方法
        2.2.1 引物設(shè)計與合成
        2.2.2 重組質(zhì)粒標(biāo)準品的構(gòu)建
            2.2.2.1 腹瀉病料的處理
            2.2.2.2 RNA的反轉(zhuǎn)錄及PCR的擴增
            2.2.2.3 目的基因的純化
            2.2.2.4 目的基因的克隆轉(zhuǎn)化
            2.2.2.5 重組質(zhì)粒的制備
        2.2.3 多重RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
        2.2.4 多重RT-PCR的特異性、敏感性、重復(fù)性試驗
        2.2.5 多重RT-PCR方法的臨床應(yīng)用
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準品的構(gòu)建
        2.3.2 多重RT-PCR退火溫度的優(yōu)化
        2.3.3 引物濃度的優(yōu)化
        2.3.4 循環(huán)數(shù)的優(yōu)化
        2.3.5 多重RT-PCR反應(yīng)條件的確定
        2.3.6 多重RT-PCR特異性試驗
        2.3.7 多重RT-PCR敏感性試驗
            2.3.7.1 單重RT-PCR敏感性試驗
            2.3.7.2 多重RT-PCR敏感性試驗
        2.3.8 多重RT-PCR重復(fù)性試驗
        2.3.9 多重RT-PCR方法的臨床應(yīng)用
    2.4 討論與結(jié)論
3. PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用
    3.1 實驗材料與方法
        3.1.1 臨床病料和病毒株
        3.1.2 主要試劑及儀器
        3.1.3 引物和TaqMan探針的設(shè)計
        3.1.4 核酸的抽提和RNA反轉(zhuǎn)錄
        3.1.5 重組質(zhì)粒標(biāo)準品的制備
        3.1.6 反應(yīng)條件的優(yōu)化和標(biāo)準曲線的制作
        3.1.7 多重TaqMan熒光定量PCR特異性、敏感性、重復(fù)性試驗
        3.1.8 多重TaqMan熒光定量PCR方法的臨床應(yīng)用
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準品的構(gòu)建
        3.2.2 TaqMan熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件的確定
        3.2.3 TaqMan熒光定量RT-PCR標(biāo)準曲線的繪制
        3.2.4 特異性分析
        3.2.5 敏感性分析
        3.2.6 重復(fù)性分析
        3.2.7 臨床樣品的檢測結(jié)果
    3.3 討論
4. 2017-2019年廣西PEDV分子流行病學(xué)研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 病料及病毒株
        4.1.2 主要試劑及儀器設(shè)備
        4.1.3 引物設(shè)計與合成
        4.1.4 腹瀉病料的處理
        4.1.5 cDNA的合成及PCR的擴增
        4.1.6 目的基因的純化
        4.1.7 目的基因的克隆轉(zhuǎn)化
        4.1.8 序列分析
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 病料的檢測
        4.2.2 S、M、N基因序列
        4.2.3 S、M、N基因同源性分析
            4.2.3.1 PEDV S基因同源性分析
            4.2.3.2 PEDV M基因同源性分析
            4.2.3.3 PEDV N基因同源性分析
        4.2.4 遺傳進化樹的繪制
            4.2.4.1 PEDV S基因序列分析和遺傳進化樹分析
            4.2.4.2 PEDV M基因遺傳進化樹分析
            4.2.4.3 PEDV N基因序列分析和遺傳進化樹分析
        4.2.5 PEDV S1氨基酸序列分析
        4.2.6 S、M、N基因進化速率的分析
    4.3 討論
5. 結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文及專利情況


【參考文獻】：
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碩士論文
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[7]豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒多重?zé)晒釸T-PCR檢測方法的建立[D]. 許夢怡.揚州大學(xué) 2016
[8]豬流行性腹瀉病毒的流行病學(xué)調(diào)查及快速檢測方法的初步建立[D]. 趙振鵬.揚州大學(xué) 2016
[9]豬腹瀉相關(guān)病毒多重和SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[D]. 吳洋.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[10]豬流行性腹瀉病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[D]. 田建興.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009



本文編號：3204797