恒定鏈（invariant chain, Ii）是脊椎動物重要的免疫分子,在MHC遞呈抗原中起重要作用。但是對Ii的研究主要集中于人和小鼠,而雞Ii的研究相對滯后。近年發(fā)展的RNA干擾技術是一種強大的基因功能研究工具,被廣泛的應用于基因功能的研究和基因治療。為研究雞Ii與MHCⅡ類分子的關系,本實驗利用RNAi技術構建了4個沉默雞Ii的慢病毒重組載體并比較了它們的沉默效率。首先,用自行設計合成的4個雞Ii基因干擾序列經(jīng)退火形成雙鏈shRNA片段,再將其插入慢病毒載體pLL3.7。應用PCR、酶切和測序鑒定后,將正確的重組慢病毒載體與輔助包裝質粒共轉染于293T細胞進行病毒的包裝,待病毒收獲處理后,再感染雞源巨噬細胞HD-11,最后用熒光定量PCR檢測雞Ii mRNA的相對表達水平。測序結果顯示我們正確構建了4個重組慢病毒干擾載體,它們分別被命名為pLL-Ii-shRNA236. pLL-Ii-shRNA376、pLL-Ii-shRNA527 和 pLL-Ii-shRNA539.共轉染293T細胞后,培養(yǎng)48h能在熒光顯微鏡下觀察到熒光表達,說明成功包裝了慢病毒,分別命名為LV-shRN... 

【文章來源】：安徽農(nóng)業(yè)大學安徽省

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
本論文常用中英文縮寫詞
文獻綜述
引言
1 材料與方法
    1.1 實驗材料
        1.1.1 質粒、菌株與細胞株
        1.1.2 工具酶與相關試劑
        1.1.3 主要實驗用試劑配置方法
        1.1.4 主要實驗儀器
    1.2 實驗方法
        1.2.1 靶向雞Ii基因shRNA序列的設計與合成
        1.2.2 互補單鏈退火形成雙鏈shRNA片段
        1.2.3 慢病毒載體質粒pLL3.7的線性化
        1.2.4 重組慢病毒載體的構建
        1.2.5 陽性克隆的PCR篩選與鑒定
        1.2.6 陽性克隆的單酶切驗證與測序
        1.2.7 重組慢病毒載體質粒的包裝
        1.2.8 慢病毒滴度的檢測
        1.2.9 熒光定量PCR檢測Ii基因mRNA相對表達水平
2 結果與分析
    2.1 靶向雞Ii基因shRNA退火后的檢測
    2.2 慢病毒載體pLL3.7的雙酶切結果
    2.3 重組慢病毒載體的PCR鑒定
    2.4 重組慢病毒載體的酶切鑒定
    2.5 重組慢病毒載體的測序結果
    2.6 無內(nèi)毒素重組質粒的檢測
    2.7 重組慢病毒的包裝與滴度檢測結果
    2.8 慢病毒感染HD-11細胞及其感染效率的測定
    2.9 總RNA的鑒定
    2.10 熒光定量PCR比較4個重組載體沉默雞Ii基因的效率
3 討論
    3.1 RNA干擾應用方式的選擇
    3.2 shRNA的設計
    3.3 慢病毒的包裝與保存
結論
參考文獻
致謝
作者簡介



本文編號：3200690