發(fā)布時(shí)間：2021-05-14 11:19

　　Leptin基因序列于1994年首次在小鼠和人類上被報(bào)道以來(lái)，其在哺乳動(dòng)物生理功能的研究已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展，具有調(diào)節(jié)能量和脂肪代謝，影響采食量，調(diào)節(jié)繁殖性狀，影響免疫等多種生物學(xué)功能，尤其是其作為調(diào)節(jié)能量、脂肪、采食的啟動(dòng)基因之一，具有極高的應(yīng)用價(jià)值。而家禽Leptin基因的研究相對(duì)進(jìn)展緩慢，最大的制約因素是禽源Leptin是否存在未有定論。有多個(gè)報(bào)道聲稱其成功克隆到Leptin基因序列；但同時(shí)也有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室在相同條件下不能重復(fù)前者的實(shí)驗(yàn)。質(zhì)疑者的主要依據(jù)是克隆到的Leptin序列同哺乳類相似度極高，甚至超過(guò)了哺乳動(dòng)物之間Leptin基因序列的相似度；而且自雞的基因組測(cè)序工作完成以來(lái)，也一直無(wú)法在基因組中檢索到已報(bào)道的Leptin基因序列。而雞Leptin受體基因（cLEPR）序列和基因表達(dá)是肯定存在的。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了其兩種異構(gòu)體存在，LEPR在哺乳動(dòng)物上，作為L(zhǎng)eptin基因的受體基因，對(duì)Leptin功能的發(fā)揮起到至關(guān)重要的作用，參與了多個(gè)代謝通路的調(diào)控。如果在雞的基因組中不存在Leptin基因，一切有關(guān)雞Leptin功能的研究除證明雞Leptin受體的存在外，沒(méi)有任何生理上的重要... 

【文章來(lái)源】：石河子大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：113 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
縮略詞表
前言
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.Leptin及其受體基因的發(fā)現(xiàn)及相關(guān)研究
        1.1 Leptin基因的發(fā)現(xiàn)
        1.2 Leptin受體基因的發(fā)現(xiàn)
        1.3 Leptin及其受體分子調(diào)控通路研究
            1.3.1 Leptin及其受體介導(dǎo)的的JAK/STAT信號(hào)通路研究進(jìn)展
            1.3.2 Leptin及其受體介導(dǎo)的SOCS3信號(hào)通路研究進(jìn)展
            1.3.3 Leptin及其受體介導(dǎo)的AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
            1.3.4 Leptin主要代謝通路研究小結(jié)
        1.4 Leptin及其受體的生物學(xué)功能研究相關(guān)進(jìn)展
            1.4.1 Leptin及其受體與生長(zhǎng)發(fā)育
            1.4.2 Leptin對(duì)生殖相關(guān)激素的影響
            1.4.3 Leptin與青春期啟動(dòng)的關(guān)聯(lián)
            1.4.4 Leptin對(duì)妊娠的調(diào)控作用
            1.4.5 Leptin與免疫之間的關(guān)系
            1.4.6 Leptin及其受體其它生物學(xué)功能小結(jié)
    2.家禽Leptin及受體相關(guān)研究進(jìn)展
        2.1 家禽Leptin基因研究與爭(zhēng)議
            2.1.1 家禽Leptin爭(zhēng)議的由來(lái)
            2.1.2 外源Leptin對(duì)家禽的影響
        2.2 家禽Leptin受體基因功能研究
        2.3 家禽Leptin及其受體研究綜述小結(jié)
    3.轉(zhuǎn)基因雞研究進(jìn)展
        3.1 轉(zhuǎn)基因雞制備技術(shù)進(jìn)展
            3.1.1 顯微注射法
            3.1.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法
            3.1.3 胚胎干細(xì)胞法
            3.1.4 原生殖細(xì)胞(PGCs)轉(zhuǎn)染法
            3.1.5 雄性生殖細(xì)胞載體法
        3.2 RNAi技術(shù)在轉(zhuǎn)基因家禽上的應(yīng)用
            3.2.1 RNAi技術(shù)同轉(zhuǎn)基因技術(shù)的結(jié)合過(guò)程
            3.2.2 RNAi技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因家禽
第二章 雞Leptin序列克隆的驗(yàn)證及LEPR組織表達(dá)譜分析
    1.材料和方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器
            1.1.3 主要試劑及配方
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 基因組DNA提取
            1.2.2 組織RNA提取
            1.2.3 PCR引物設(shè)計(jì)
            1.2.4 PCR擴(kuò)增程序
            1.2.5 PCR引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增
            1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)分析
    2.結(jié)果與分析
        2.1 DNA及組織RNA提取結(jié)果
        2.2 Leptin基因PCR擴(kuò)增結(jié)果
        2.3 LEPR熒光定量結(jié)果
    3.討論
        3.1 雞Leptin基因存在的爭(zhēng)議
        3.2 雞LEPR基因的組織表達(dá)譜分析
第三章 RNAi驗(yàn)證LEPR在雞前脂肪細(xì)胞中的功能及代謝通路變化
    1.材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
            1.1.3 主要試劑、抗體及配方
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
            1.2.2 細(xì)胞的凍存復(fù)蘇
            1.2.3 shRNA干擾片段設(shè)計(jì)
            1.2.4 載體PLLU2G-shLEPR的構(gòu)建
            1.2.5 質(zhì)粒提取
            1.2.6 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染雞前脂肪細(xì)胞
            1.2.7 細(xì)胞RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄
            1.2.8 熒光定量PCR分析
            1.2.9 雞前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
    2.結(jié)果與分析
        2.1 雞前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果
        2.2 RNAi質(zhì)粒載體的構(gòu)建
            2.2.1 用XhoⅠ和HpaⅠ酶切PLLU2G骨架載體
            2.2.2 菌落PCR鑒定PLLU2G-shLEPR圖譜
            2.2.3 載體測(cè)序結(jié)果
        2.3 shLEPR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雞前脂肪細(xì)胞的熒光檢測(cè)結(jié)果
        2.4 質(zhì)粒干擾效率檢測(cè)
            2.4.1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞RNA提取結(jié)果
            2.4.2 反轉(zhuǎn)錄后內(nèi)參基因檢測(cè)
            2.4.3 待測(cè)基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)
            2.4.4 熒光定量溶解曲線檢測(cè)
            2.4.5 熒光定量PCR的干擾效率檢測(cè)結(jié)果
        2.5 RNAi處理后各基因表達(dá)量分析
            2.5.1 RNAi處理后基因表達(dá)量初步統(tǒng)計(jì)
            2.5.2 RNAi處理基因表達(dá)量分析
        2.6 RNAi處理后對(duì)細(xì)胞增殖速度的影響
    3.討論
        3.1 雞前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化
            3.1.1 雞前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化體系的建立
            3.1.2 不同shLEPR組別細(xì)胞增殖結(jié)果
        3.2 RNAi干擾后各基因表達(dá)量變化
            3.2.1 shLERR干擾效率分析
            3.2.2 shLEPR干擾后相關(guān)基因表達(dá)分析
        3.3 shLEPR干擾前脂肪細(xì)胞研究小結(jié)
第四章 不同飼養(yǎng)條件下LEPR及其代謝通路基因表達(dá)變化分析
    1.材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
            1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及配置
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 實(shí)驗(yàn)用雞的飼養(yǎng)分組與飼養(yǎng)方式
            1.2.2 組織RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
            1.2.3 熒光定量檢測(cè)基因表達(dá)量
    2.結(jié)果與分析
        2.1 體重測(cè)定結(jié)果
        2.2 禁食及正常飼喂組熒光定量差異分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            2.2.1 熒光定量數(shù)據(jù)
            2.2.2 各基因表達(dá)柱狀圖分析
    3.討論
        3.1 禁食3天對(duì)體重增加的調(diào)整
        3.2 禁食及正常飼喂組熒光定量差異分析
            3.2.1 STAT3和NPY基因表達(dá)變化
            3.2.2 AdipoR2基因和CPT-1基因表達(dá)變化
            3.2.3 LEPR基因表達(dá)變化綜合分析
        3.3 禁食對(duì)LEPR等基因影響研究小結(jié)
第五章 shLEPR轉(zhuǎn)基因雞的構(gòu)建及相關(guān)檢測(cè)
    1.材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
            1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及配置
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 shLEPR轉(zhuǎn)染用種蛋的處理
            1.2.2 轉(zhuǎn)基因個(gè)體綠色熒光蛋白觀測(cè)
            1.2.3 轉(zhuǎn)基因個(gè)體基因組PCR檢測(cè)
            1.2.4 轉(zhuǎn)基因個(gè)體Western-blot鑒定
            1.2.5 轉(zhuǎn)基因個(gè)體體重、體尺測(cè)量及相關(guān)器官重量測(cè)量
            1.2.6 轉(zhuǎn)基因個(gè)體相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè)
    2.結(jié)果及分析
        2.1 shLEPR轉(zhuǎn)基因測(cè)定
            2.1.1 孵化率統(tǒng)計(jì)
            2.1.2 熒光信號(hào)檢測(cè)
            2.1.3 轉(zhuǎn)基因結(jié)果分子檢測(cè)
        2.2 shLEPR轉(zhuǎn)基因結(jié)果分析
            2.2.1 轉(zhuǎn)基因個(gè)體表型性狀結(jié)果與分析
            2.2.2 轉(zhuǎn)基因個(gè)體相關(guān)通路基因表達(dá)變化
    3.討論
        3.1 shLEPR轉(zhuǎn)基因效果討論
            3.1.1 胚盤下腔注射效果分析
            3.1.2 轉(zhuǎn)基因結(jié)果檢測(cè)與分析
        3.2 LEPR干擾后個(gè)體表型及基因通路變化分析
            3.2.1 LEPR基因表達(dá)及表型分析
            3.2.2 相關(guān)基因表達(dá)量分析
        3.3 shLEPR轉(zhuǎn)基因討論小結(jié)
全文結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn)
    全文結(jié)論
    創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
附表
    附表1 干擾質(zhì)粒載體測(cè)序結(jié)果
作者簡(jiǎn)介
致謝
導(dǎo)師評(píng)閱表


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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