發(fā)布時間：2021-04-24 08:27

　　豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS,俗稱藍耳�。┦怯韶i繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）引起的一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的免疫抑制性疾病。疫苗接種是預防本病的重要手段之一。但是,由于PRRSV具有嚴格的細胞嗜性,原代易感細胞如豬肺泡巨噬細胞（PAM）等難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求,而繼代細胞如非洲綠猴腎上皮細胞（Marc145）等因缺乏唾液酸黏附素（Sn）受體限制了某些PRRSV田間流行株的體外增殖,這十分不利于現(xiàn)有PRRS疫苗免疫效果的持續(xù)性評價及其疫苗種子庫的建立,阻礙了PRRS疫情的防控實踐。故此,迫切需要構(gòu)建PRRSV易感的重組細胞系來解決這一瓶頸性問題�！灸康摹勘菊撐臄M借助CRISPR/Cas9技術(shù)對Marc145細胞的基因組進行修飾和改造,構(gòu)建穩(wěn)定表達豬源Sn（p Sn）的Marc145細胞株（p Sn-Marc145）,以期提高PRRSV的細胞吸附能力及其適應性和感染性,為PRRSV的基礎(chǔ)與應用研究提供可靠的細胞平臺支撐�！痉椒ā勘菊撐倪x擇Marc145細胞第11號染色體RACGAP1和ASIC1基因之間的內(nèi)含子序列作為打靶區(qū)域。首先,利用生物學軟件設計單向?qū)NA（sg RNA）... 

【文章來源】：甘肅農(nóng)業(yè)大學甘肅省

【文章頁數(shù)】：118 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Summary
縮略詞表
第一章 CRISPR/ Cas9 技術(shù)在哺乳動物細胞中的應用
    1.1 CRISPR/ Cas9技術(shù)的研究進展
        1.1.1 CRISPR/ Cas9技術(shù)的發(fā)展歷程
        1.1.2 CRISPR/ Cas分類
        1.1.3 CRISPR/ Cas9 技術(shù)及其作用的基本原理
        1.1.4 CRISPR/ Cas9 的基因修復路徑
    1.2 CRISPR/ Cas9技術(shù)在生產(chǎn)病毒性疫苗哺乳動物細胞株的應用
        1.2.1 病毒性疫苗用哺乳動物細胞系的簡介
        1.2.2 CRISPR/ Cas9技術(shù)在病毒性疫苗哺乳動物細胞的應用
第二章 豬源唾液黏附素受體研究進展
    1.1 Sn受體結(jié)構(gòu)
    1.2 PRRSV與 Sn受體作用機理
        1.2.1 PRRSV流行現(xiàn)狀
        1.2.2 PRRSV與 Sn受體的相互作用
        1.2.3 Sn受體與PRRSV的免疫作用機理
第三章 Marc145細胞基因組打靶位點的篩選及驗證
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 細胞和載體
            1.1.2 儀器設備
            1.1.3 試劑
        1.2 方法
            1.2.1 打靶質(zhì)粒構(gòu)建
            1.2.2 eGFP供體質(zhì)粒構(gòu)建
            1.2.3 轉(zhuǎn)染
            1.2.4 Surveyor核酸酶檢測
            1.2.5 Junction PCR檢測
            1.2.6 Southern Blotting檢測
    2 結(jié)果
        2.1 Marc145 細胞基因組打靶位點的選擇和sgRNA的設計及篩選
        2.2 打靶質(zhì)粒和供體質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3 Cas9切割效率檢測
        2.4 陽性細胞克隆鑒定
    3 討論
    4 本章小結(jié)
第四章 不同Cas9在Marc145 細胞的切割效率及重組效率分析
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 打靶載體
            1.1.2 儀器設備
            1.1.3 試劑
        1.2 方法
            1.2.1 eSpCas9 打靶質(zhì)粒構(gòu)建
            1.2.2 Cas9n雙打靶質(zhì)粒構(gòu)建
            1.2.3 pSpCas9、Cas9n（雙打靶）和e Cas9 打靶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染
            1.2.4 Surveyor核酸酶檢測三種打靶質(zhì)粒的切割效率
            1.2.5 Junction PCR檢測同源重組效率
    2 結(jié)果
        2.1 三種打靶質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2 三種打靶質(zhì)粒的切割效率
        2.3 Junction PCR檢測同源重組效率
    3 討論
    4 本章小結(jié)
第五章 穩(wěn)定表達豬源唾液酸黏附素Marc145細胞系的建立
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 載體
            1.1.2 儀器設備
            1.1.3 試劑
        1.2 方法
            1.2.1 嘌呤霉素濃度滴定
            1.2.2 豬源Sn供體質(zhì)粒構(gòu)建
            1.2.3 豬源Sn供體質(zhì)粒與Cas9n（雙sgRNA）質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染
            1.2.4 壓力篩選陽性克隆
            1.2.5 陽性細胞克隆鑒定
            1.2.6 pSn-Marc145 單克隆細胞的生物學特性分析
    2 結(jié)果
        2.1 豬源Sn供體質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2 陽性細胞克隆鑒定
            2.2.1 Junction PCR結(jié)果
            2.2.2 Western Blotting結(jié)果
            2.2.3 間接免疫熒光檢測結(jié)果
            2.2.4 Southern Blotting結(jié)果
        2.3 單克隆Marc145細胞生物學特性鑒定
            2.3.1 陽性克隆核型分析結(jié)果
            2.3.2 細胞形態(tài)觀察及生長特性分析結(jié)果
    3 討論
    4 本章小結(jié)
第六章 pSn-Marc145 細胞對PRRS疫苗毒株生物學特性的影響
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 細胞及PRRSV毒株
            1.1.2 儀器設備
            1.1.3 試劑
        1.2 方法
            1.2.1 病毒傳代
            1.2.2 蝕斑形成試驗
            1.2.3 間接免疫熒光
            1.2.4 病毒生長曲線
            1.2.5 Western Blotting
    2 結(jié)果
        2.1 不同PRRSV在 Marc145和pSn-Marc145 細胞的蝕斑表型
        2.2 間接免疫熒光檢測結(jié)果
            2.2.1 VR2332
            2.2.2 CHIR
            2.2.3 JXA1
            2.2.4 R98
        2.3 病毒生長曲線的繪制結(jié)果
            2.3.1 VR2332
            2.3.2 CHIR
            2.3.3 JXA1
            2.3.4 R98
        2.4 Western Blotting結(jié)果
    3 討論
    4 本章小結(jié)
第七章 PRRSV對 pSn-Marc145 細胞的感染性研究
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 細胞及PRRSV毒株
            1.1.2 儀器設備
            1.1.3 試劑
        1.2 方法
            1.2.1 病毒的傳代培養(yǎng)
            1.2.2 PRRSV遺傳變異分析
            1.2.3 實時熒光定量PCR
            1.2.4 蝕斑形成試驗
            1.2.5 病毒生長曲線
    2 結(jié)果
        2.1 PRRSV傳代培養(yǎng)
        2.2 PRRSV遺傳變異分析結(jié)果
        2.3 實時熒光定量qPCR檢測結(jié)果
        2.4 蝕斑形成試驗結(jié)果
        2.5 病毒生長曲線檢測結(jié)果
    3 討論
    4 本章小結(jié)
全文結(jié)論
參考文獻
致謝
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【參考文獻】：
期刊論文
[1]A Novel DT40 Antibody Library for the Generation of Monoclonal Antibodies[J]. Bei Wang,Fei Wang,He Huang,Zhendong Zhao.  Virologica Sinica. 2019(06)
[2]Homologous recombination mediates stable Fah gene integration and phenotypic correction in tyrosinaemia mouse-model[J]. Norman Junge,Qinggong Yuan,Thu Huong Vu,Simon Krooss,Christien Bednarski,Asha Balakrishnan,Toni Cathomen,Michael P Manns,Ulrich Baumann,Amar Deep Sharma,Michael Ott.  World Journal of Hepatology. 2018(02)
[3]甲型肝炎減毒活疫苗病毒的水平傳播[J]. 黃小琴,曹逸云,譚順革,白惠珠,邵聰文,龍潤?quán)l(xiāng),周德久,董德祥.  中華醫(yī)學雜志. 2001(08)



本文編號：3157031