為了構(gòu)建敖漢細(xì)毛羊Hoxa7基因表達(dá)載體以及研究表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后基因表達(dá)量的變化,試驗從40日齡敖漢細(xì)毛羊肩部皮膚提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,參照GenBank中Hoxa7基因的CDS區(qū)序列設(shè)計1對引物;將PCR擴增獲取的Hoxa7基因CDS片段連接到pEASYTM-T1載體上,構(gòu)建pEASYTM-T1-Hoxa7克隆載體,將克隆載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中;從pEASYTM-T1載體上切下Hoxa7基因片段,連接到pcDNA3.1表達(dá)載體上,再次轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中;將重組表達(dá)載體pcDNA3.1-Hoxa7瞬時轉(zhuǎn)染到傳代的成纖維細(xì)胞中,利用實時熒光定量PCR技術(shù)、Western-blot方法檢測成纖維細(xì)胞中Hoxa7基因的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明:重組表達(dá)載體pcDNA3.1-Hoxa7構(gòu)建成功;瞬時轉(zhuǎn)染到成纖維細(xì)胞中后, Hoxa7基因的mRNA和蛋白表達(dá)量均極顯著升高（P<0.01）。說明敖漢細(xì)毛羊Hoxa7基因在成纖維細(xì)胞中能夠高效表達(dá)。 

【文章來源】：黑龍江畜牧獸醫(yī). 2020,(11)北大核心

【文章頁數(shù)】：7 頁

【文章目錄】：
1 材料
    1.1 試驗動物
    1.2 主要試劑
    1.3 主要儀器
2 方法
    2.1 引物的設(shè)計與合成
    2.2 目的基因的PCR擴增
    2.3 TA克隆測序
    2.4 Hoxa7基因與pcDNA3.1表達(dá)載體重組
    2.5 成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
    2.6 實時熒光定量PCR擴增
    2.7 Hoxa7基因編碼蛋白的檢測
    2.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 Hoxa7基因的PCR擴增
    3.2 TA克隆測序
    3.3 Hoxa7基因與pcDNA3.1表達(dá)載體重組
        3.3.1 克隆載體的鑒定及提取
        3.3.2 克隆載體及pcDNA3.1表達(dá)載體雙酶切
        3.3.3 pcDNA3.1表達(dá)載體與Hoxa7基因的連接鑒定
        3.3.4 重組表達(dá)載體菌液的測序
    3.4 成纖維細(xì)胞觀察
        3.4.1 原代細(xì)胞觀察
        3.4.2 傳代細(xì)胞觀察
    3.5 實時熒光定量PCR擴增
    3.6 Hoxa7基因編碼蛋白的檢測
4 討論
5 結(jié)論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3151114