基于體內調控細菌Ⅵ型分泌蛋白的減毒沙門氏菌裂解系統(tǒng)的構建
發(fā)布時間：2021-04-11 18:45
重組細菌載體疫苗,尤其是重組減毒沙門氏菌疫苗（Recombinant Attenuated Salmonella Vaccine,RASV）,因其可以有效地激發(fā)宿主產生粘膜免疫反應、體液免疫反應以及細胞免疫反應的特點,已經被廣泛用作遞送保護性抗原和核酸疫苗的載體。RASV是具有構完整細菌結構的活疫苗,因此重組疫苗攜帶的外源性抗原或真核表達質粒難以從細菌中釋放出來而發(fā)揮作用,而在體內殘留的沙門氏菌也會造成生物污染。為解決上述問題,本研究基于細菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)（TypeⅥSecretion System,T6SS）分泌的肽聚糖水解蛋白,設計了一系列由體內誘導啟動子調控的裂解組合,并最終篩選出了一組由Mg2+調控的體內裂解系統(tǒng)去遞送外源抗原。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的Ⅵ型分泌系統(tǒng)能夠分泌兩種肽聚糖水解因子Tse1和Tse3,這兩種蛋白能夠破壞細菌細胞壁結構造成細菌裂解死亡。本研究首先選用了三種內源性表達啟動子,分別是限Mg2+調控啟動子PpagC、限Fe2+調控啟動子Pviu B以及組成型表達啟動子araC P
【文章來源】：西南大學重慶市 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：97 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
Fe2+調控的裂解系統(tǒng)[31]
西南大學碩士學位論文18圖3-1調控裂解質粒的構建模型圖Fig.3-1Diagramofmodelillustratingtheconstructionforregulatedlysisplasmids（1）細菌基因組的抽提為了獲取啟動子PpagC（來源于S.Typhimurium），啟動子PviuB（來源于V.cholerae），裂解基因tse1和tse3（來源于P.aeruginosa），需要提取相應菌株的基因組以作為擴增模板。分別將UK-1菌株、V.choleraeO1菌株、P.aeruginosaPAO1菌株接種劃線到固體LB培養(yǎng)基上進行復蘇，次日，挑選平板上的單菌落分別接種于5mL液體LB中過夜37℃振蕩培養(yǎng)；第二日，各吸取1mL菌液，按照細菌基因組抽提試劑盒（天根，目錄DP302）的說明書進行基因組的抽提，抽提完的基因組經核酸蛋白測定儀（NanoDrop2000，ThermoScientific）測定濃度后保存于-20℃。（2）細菌質粒的提取為了獲取信號肽序列SS1（blass）和SS2（pelBss），以及表達載體，需要從相應宿主菌中提取質粒以作為擴增模板。將保存pYA4088質粒的χ9241菌株接種至LB固體培養(yǎng)基復蘇，保存pYA4518質粒的χ7232菌株接種至LB（Cm+）固體培養(yǎng)基復蘇，保存pSW220質粒的χ6097菌株接種至LB（Cm+）固體培養(yǎng)基復蘇；次日挑取各培養(yǎng)基上的單菌落分別在液體LB（Cm+或無Cm+）的培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)，分別取1mL菌液，按照質粒小提試劑盒（天根，目錄DP103）的說明書進行操作。（3）目的片段的擴增PCR所需的引物、模板以及擴增產物見表3-6，PCR反應體系見表3-7，PCR反應條件見3-8。表3-6PCR所需引物、模板及PCR產物
第3章調控裂解組合的構建、表達與篩選253.3結果與分析3.3.1裂解質粒的構建（1）為了獲得所需的各個基因片段，首先使用PCR的方法將啟動子PpagC和PviuB，信號肽序列SS1和SS2，裂解基因tse1和tse3以及載體片段V1和V2從相應的模板中擴增出來，其中V2載體中帶有Ptrc序列。經電泳鑒定，各個PCR產物大小均符合預期。其中SS1有6個片段SS1-1~SS6-1，SS2有6個片段SS2-1~SS2-6，PpagC有2個片段PpagC-1和PpagC-2，PviuB有兩個片段PviuB-1和PviuB-2，各個重復片段之間除了用于融合PCR的接口序列不同外，其他序列均一致。目的片段PCR鑒定結果見圖3-2。圖3-2目的片段的PCR擴增Fig.3-2PCRproductsoftargetedfragments.(A)M:DNAMarker;1~6:SS2-1~SS2-6;7~12:SS1-6~SS1-6(B)M:DNAMarker;1:PpagC-1;2:PpagC-2;3:PviuB-1;4:PviuB-2;5:tse1-1;6:tse1-2;7:tse3-1;8:tse3-2;9:V1;10:V2（2）獲得純化的目的片段序列之后，按照本章介紹的方法進行PCR片段的融合。首先進行兩個片段之間的融合，即將SS1/SS2和tse1/tse3片段進行融合，分別獲得融合片段SS1-tse1-1~SS1-tse1-3、SS1-tse3-1~SS1-tse3-3、SS2-tse1-1~SS2-
【參考文獻】：
期刊論文
[1]裂解系統(tǒng)在細菌載體疫苗中的應用[J]. 唐一波,劉青,李沛,羅紅艷,孔慶科. 生物工程學報. 2019(03)
本文編號：3131767
【文章來源】：西南大學重慶市 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：97 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
Fe2+調控的裂解系統(tǒng)[31]
西南大學碩士學位論文18圖3-1調控裂解質粒的構建模型圖Fig.3-1Diagramofmodelillustratingtheconstructionforregulatedlysisplasmids（1）細菌基因組的抽提為了獲取啟動子PpagC（來源于S.Typhimurium），啟動子PviuB（來源于V.cholerae），裂解基因tse1和tse3（來源于P.aeruginosa），需要提取相應菌株的基因組以作為擴增模板。分別將UK-1菌株、V.choleraeO1菌株、P.aeruginosaPAO1菌株接種劃線到固體LB培養(yǎng)基上進行復蘇，次日，挑選平板上的單菌落分別接種于5mL液體LB中過夜37℃振蕩培養(yǎng)；第二日，各吸取1mL菌液，按照細菌基因組抽提試劑盒（天根，目錄DP302）的說明書進行基因組的抽提，抽提完的基因組經核酸蛋白測定儀（NanoDrop2000，ThermoScientific）測定濃度后保存于-20℃。（2）細菌質粒的提取為了獲取信號肽序列SS1（blass）和SS2（pelBss），以及表達載體，需要從相應宿主菌中提取質粒以作為擴增模板。將保存pYA4088質粒的χ9241菌株接種至LB固體培養(yǎng)基復蘇，保存pYA4518質粒的χ7232菌株接種至LB（Cm+）固體培養(yǎng)基復蘇，保存pSW220質粒的χ6097菌株接種至LB（Cm+）固體培養(yǎng)基復蘇；次日挑取各培養(yǎng)基上的單菌落分別在液體LB（Cm+或無Cm+）的培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)，分別取1mL菌液，按照質粒小提試劑盒（天根，目錄DP103）的說明書進行操作。（3）目的片段的擴增PCR所需的引物、模板以及擴增產物見表3-6，PCR反應體系見表3-7，PCR反應條件見3-8。表3-6PCR所需引物、模板及PCR產物
第3章調控裂解組合的構建、表達與篩選253.3結果與分析3.3.1裂解質粒的構建（1）為了獲得所需的各個基因片段，首先使用PCR的方法將啟動子PpagC和PviuB，信號肽序列SS1和SS2，裂解基因tse1和tse3以及載體片段V1和V2從相應的模板中擴增出來，其中V2載體中帶有Ptrc序列。經電泳鑒定，各個PCR產物大小均符合預期。其中SS1有6個片段SS1-1~SS6-1，SS2有6個片段SS2-1~SS2-6，PpagC有2個片段PpagC-1和PpagC-2，PviuB有兩個片段PviuB-1和PviuB-2，各個重復片段之間除了用于融合PCR的接口序列不同外，其他序列均一致。目的片段PCR鑒定結果見圖3-2。圖3-2目的片段的PCR擴增Fig.3-2PCRproductsoftargetedfragments.(A)M:DNAMarker;1~6:SS2-1~SS2-6;7~12:SS1-6~SS1-6(B)M:DNAMarker;1:PpagC-1;2:PpagC-2;3:PviuB-1;4:PviuB-2;5:tse1-1;6:tse1-2;7:tse3-1;8:tse3-2;9:V1;10:V2（2）獲得純化的目的片段序列之后，按照本章介紹的方法進行PCR片段的融合。首先進行兩個片段之間的融合，即將SS1/SS2和tse1/tse3片段進行融合，分別獲得融合片段SS1-tse1-1~SS1-tse1-3、SS1-tse3-1~SS1-tse3-3、SS2-tse1-1~SS2-
【參考文獻】：
期刊論文
[1]裂解系統(tǒng)在細菌載體疫苗中的應用[J]. 唐一波,劉青,李沛,羅紅艷,孔慶科. 生物工程學報. 2019(03)
本文編號：3131767
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