豬流感病毒（swine influenza virus,SIV）是由8條單股、負(fù)鏈RNA組成,屬于正黏病毒科。目前國(guó)內(nèi)豬群中SIV主要流行亞型為H1N1、H1N2和H3N2,其中三源重組H1N1亞型SIV是重要的流行毒株之一。前期研究數(shù)據(jù)表明:與歐洲類(lèi)禽H1N1亞型SIV（A/Swine/Tianjin/6/2011（H1N1）,簡(jiǎn)稱(chēng)TJ6）相比,新型三源重組SIV（A/Swine/Tianjin/10/2013（H1N1）,簡(jiǎn)稱(chēng)TJ10）在哺乳動(dòng)物模型體內(nèi)的致病力明顯增強(qiáng),TJ10的NS和核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）基因協(xié)同促進(jìn)了病毒的復(fù)制和致病能力。本研究將進(jìn)一步探索三源重組H1N1亞型SIV的分子致病機(jī)制,在一定程度上為下一次流感大流行提供了有力的數(shù)據(jù)和理論支持。非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1）是流感病毒的一種致病因子,它廣泛地與細(xì)胞和病毒蛋白互作以促進(jìn)病毒的高效復(fù)制,抑制宿主抗病毒反應(yīng)。流感病毒感染宿主后,宿主會(huì)產(chǎn)生抗病毒的天然免疫應(yīng)答。宿主模式識(shí)別受體可介導(dǎo)宿主的抗病毒信號(hào)通路,在多種機(jī)制的調(diào)控下也會(huì)誘導(dǎo)干擾素以及其他相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。RIG-I存在于感染細(xì)胞的胞質(zhì)中,它是啟動(dòng)針對(duì)IA... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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不同病毒IFN-β的表達(dá)情況

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章不同豬流感病毒NS1基因抑制β干擾素表達(dá)的初步研究16圖2-1不同病毒IFN-β的表達(dá)情況Fig.2-1IFN-βexpressionofdifferentviruses2.3.2NS1重組質(zhì)粒構(gòu)建2.3.2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果根據(jù)設(shè)計(jì)的相關(guān)引物，分別擴(kuò)增TJ6與TJ10的NS1，其PCR擴(kuò)增結(jié)果如下：圖2-2TJ6與TJ10的NS1PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2-2PCRproductsofNS1ofTJ6andTJ10M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；左圖1-3：TJ6NS1擴(kuò)增結(jié)果；右圖1-2：TJ10NS1擴(kuò)增結(jié)果M:DNAMarker(DL2000);Leftpicture1-3:AmplificationresultsofTJ6NS1;Rightpicture1-2:AmplificationresultsofTJ10NS12.3.2.2菌液鑒定結(jié)果放入搖床搖菌6h以后便可以取少量菌液進(jìn)行菌液PCR鑒定，驗(yàn)證條帶大小正確與否，其結(jié)果如下圖所示：

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章不同豬流感病毒NS1基因抑制β干擾素表達(dá)的初步研究17圖2-3TJ6與TJ10的NS1PCR菌液鑒定結(jié)果Fig.2-3MicrobialidentificationofNS1ofTJ6andTJ10M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；左圖1-10：重組質(zhì)粒TJ6NS1菌液鑒定結(jié)果；右圖1-10：重組質(zhì)粒TJ10NS1菌液鑒定結(jié)果M:DNAMarker(DL2000);Leftpicture1-10:IdentificationresultsofrecombinantplasmidTJ6NS1;Rightpicture1-10:IdentificationresultsofrecombinantplasmidTJ10NS12.3.2.3NS1重組質(zhì)粒蛋白表達(dá)圖分別轉(zhuǎn)染不同劑量的TJ6與TJ10的NS1于A549細(xì)胞中，24h后收取樣品通過(guò)Westernblot檢測(cè)蛋白大小以及是否表達(dá)，其結(jié)果如下：圖2-4TJ6與TJ10的NS1蛋白表達(dá)Fig.2-4ProteinexpressionofNS1ofTJ6andTJ10提取質(zhì)粒后送生物公司測(cè)序，經(jīng)比對(duì)序列后發(fā)現(xiàn)結(jié)果無(wú)誤，以上種種結(jié)果表明TJ6與TJ10的NS1重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.3.3強(qiáng)弱毒NS1對(duì)于β干擾素的抑制差異鑒于兩株病毒誘導(dǎo)β干擾素存在差異，于是構(gòu)建了TJ6與TJ10的NS1重組質(zhì)粒，單獨(dú)研究其對(duì)于β干擾素的抑制情況，在生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞上共轉(zhuǎn)染構(gòu)建的重組質(zhì)粒、IFN-β啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒以及海腎螢光素酶內(nèi)參質(zhì)粒，24h后加Poly：IC刺激，24h后根據(jù)雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，不論P(yáng)oly：IC刺激的量為1ug還是2ug，6NS1與10NS1抑制β干擾素差異均為


本文編號(hào)：3131450