豬流行性腹瀉病毒（PEDV）是引起豬流行性腹瀉（PED）的病原,也是豬重要的腸道病原之一；本病以引起豬的急性水樣腹瀉、嘔吐和迅速脫水為主要特征,5日齡內(nèi)的仔豬感染后死亡率可達100%。因此,我國大部分豬場都會用疫苗來預防PED。但是,從2010年以來,PED突然在我國南方地區(qū)暴發(fā)并迅速傳播到全國各地,給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,而疫苗在這次的PED流行中并沒有給豬群應有的保護。為了揭示豬場PED弱毒疫苗免疫失敗的原因,本試驗從廣東、廣西和湖北的3個規(guī)模化豬場得到了3株P(guān)ED弱毒活疫苗,首先對3株疫苗毒株進行M基因的測序,結(jié)果顯示3株疫苗毒株有兩個疫苗毒株的序列完全一樣,另一個毒株有1個核苷酸的突變,說明3株疫苗毒株來源相同。我們選取其中一株疫苗毒株,進行基因組全序列測定,并分析疫苗毒株與流行毒株的全序列、S、M、 N、ORF3的核苷酸和氨基酸的序列差異,從基因水平上分析豬場免疫失敗的原因。遺傳進化結(jié)果顯示,無論在全基因組水平還是在各個基因水平,疫苗毒株與目前流行毒株的親緣關(guān)系都很遠。在全基因組水平,疫苗毒株與目前流行毒株的同源性為97.1%-97.2%；在三個結(jié)構(gòu)基因S、M、N... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1. 文獻綜述
    1.1 豬流行性腹瀉概述
        1.1.1 豬流行性腹瀉的危害
        1.1.2 PEDV的病原特性
        1.1.3 PEDV的培養(yǎng)特性
        1.1.4 PED的流行病學
        1.1.5 PED的診斷
        1.1.6 PED的治療
    1.2 PEDV的基因組和主要蛋白的分子特征
        1.2.1 5'UTR
        1.2.2 ORF1
        1.2.3 S蛋白
        1.2.4 ORF3
        1.2.5 M蛋白
        1.2.6 E蛋白
        1.2.7 N蛋白
        1.2.8 3’UTR
    1.3 PED疫苗的研究
        1.3.1 滅活疫苗
        1.3.2 弱毒疫苗
        1.3.3 基因工程疫苗
        1.3.4 核酸疫苗
        1.3.5 轉(zhuǎn)基因植物疫苗
    1.4 冠狀病毒感染性克隆研究進展
2. 研究目的與意義
3. 材料與方法
    3.1 材料
        3.1.1 PEDV毒株、菌種和質(zhì)粒
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器設備
        3.1.4 緩沖液及培養(yǎng)基
        3.1.5 本試驗用的引物
    3.2 試驗方法
        3.2.1 PEDV疫苗毒株的鑒定
        3.2.2 PEDV疫苗株全長cDNA的克隆
        3.2.3 PEDV N基因的克隆
        3.2.4 疫苗毒株全基因組、S、ORF3、M、N基因的序列分析比較
4. 結(jié)果及分析
    4.1 PEDV疫苗毒株的鑒定
    4.2 pMD-18T-M重組質(zhì)粒鑒定
    4.3 PEDV全長cDNA的克隆
    4.4 體外轉(zhuǎn)錄和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄5’端和3’端的鑒定
        4.4.1 體外轉(zhuǎn)錄的PEDV 5’端和3’端的鑒定
        4.4.2 體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的PEDV 5’端和3’端的鑒定
    4.5 PEDV N基因的真核重組質(zhì)粒的鑒定
    4.6 疫苗毒株的基因組結(jié)構(gòu)及分子特征
    4.7 疫苗毒株S基因的分子特征及序列分析
    4.8 疫苗毒株OFR3基因的分子特征及序列分析
    4.9 疫苗毒株M基因的分子特征及序列分析
    4.10 疫苗毒株N基因的分子特征及序列分析
5. 討論
    5.1 疫苗毒株的同源性分析
    5.2 關(guān)于疫苗毒株與參考毒株的全序列分析
    5.3 關(guān)于S基因的序列分析
    5.4 關(guān)于ORF3的序列分析
    5.5 關(guān)于M基因的序列分析
    5.6 關(guān)于N基因的序列分析
    5.7 關(guān)于PEDV感染性克隆的構(gòu)建
6. 結(jié)論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]豬流行性腹瀉病毒核衣殼蛋白與感染細胞核磷蛋白的共定位分析[J]. 呂茂杰,陳建飛,時洪艷,陳小金,范秀萍,申識川,馮力.  微生物學報. 2011(05)
[2]豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬A群輪狀病毒多重RT-PCR檢測方法的建立及臨床應用[J]. 張坤,何啟蓋.  畜牧獸醫(yī)學報. 2010(08)
[3]表達豬流行性腹瀉病毒中和抗原位點的重組干酪乳桿菌免疫小鼠誘導的免疫應答[J]. 葛俊偉,姜艷平,汪淼,喬薪瑗,劉敏,唐麗杰,李一經(jīng).  中國獸醫(yī)科學. 2010(07)
[4]表面表達豬流行性腹瀉病毒核蛋白蛋白的重組干酪乳桿菌誘導產(chǎn)生的免疫應答[J]. 葛俊偉,姜艷平,汪淼,喬薪瑗,劉敏,唐麗杰,李一經(jīng).  生物工程學報. 2009(06)
[5]豬流行性腹瀉病毒S蛋白受體結(jié)合域的分析[J]. 孫東波,陳建飛,時洪艷,申識川,呂茂杰,范秀萍,陳洪巖,馮力.  畜牧獸醫(yī)學報. 2009(04)
[6]豬流行性腹瀉病毒S1蛋白在干酪乳桿菌中的分泌表達及免疫原性分析[J]. 葛俊偉,姜艷平,汪淼,喬薪瑗,徐義剛,唐麗杰,李一經(jīng).  中國預防獸醫(yī)學報. 2009(04)
[7]豬流行性腹瀉病毒纖突蛋白基因克隆與序列分析[J]. 李建強,柳紀省,蘭喜,程杰,楊敏,吳潤,殷相平,李寶玉,李學瑞,楊彬.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報. 2007(04)
[8]豬流行性腹瀉病毒分子生物學研究進展[J]. 孫東波,馮力,時洪艷,陳建飛.  動物醫(yī)學進展. 2006(10)
[9]冠狀病毒全長cDNA感染性克隆研究進展[J]. 趙卓.  國外醫(yī)學.病毒學分冊. 2004(04)
[10]流行性乙型腦炎病毒（JEV）全長感染性克隆的制備及恢復病毒的獲得[J]. 黃鶯,賈麗麗,孫志偉,王志偉,俞煒源,俞永新.  病毒學報. 2003(04)

碩士論文
[1]豬流行性腹瀉病毒重組沙門氏菌的構(gòu)建及免疫原性分析[D]. 徐麗麗.華中農(nóng)業(yè)大學 2011
[2]豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉二聯(lián)核酸疫苗免疫效力研究[D]. 孟凡丹.東北農(nóng)業(yè)大學 2011



本文編號：3109512