干擾素是一類重要的細胞因子,具有廣譜的抗病毒活性,良好的抑制細胞分裂、抗腫瘤活性以及高效的免疫調(diào)節(jié)等功能。近來,禽類相關(guān)的干擾素研究正不斷地深入,尤其是就雞和鴨干擾素而言,但鵝干擾素的相關(guān)研究報道還尚少。本實驗選擇抗病毒活性較強的Ⅰ型α干擾素,參考GenBank上發(fā)表的鵝IFN-a基因序列（HQ115583）設(shè)計引物,以地方品種揚州鵝（Yangzhou goose）為實驗動物。采用RT-PCR的方法成功擴增出揚州鵝IFN-a全基因與成熟基因片段,大小分別為576bp、486bp。將IFN-a全長基因克隆至pGEM-T載體中,將重組質(zhì)粒pGEM-T-GoIFN-a送至測序,結(jié)果表明擴增出的揚州鵝IFN-a全長基因與HQ115583在核苷酸水平上同源性達99.6%。將IFN-a成熟基因克隆至pET32a（+）載體中,構(gòu)建了原核表達載體pET32a-mGoIFN-α。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a（DE3）后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達得到大小為36.3kDa的重組融合蛋白。對上述包涵體蛋白進行純化,基本上能夠得到單一的特異性條帶,并通過Western Blotting檢測純化后蛋白,結(jié)果與預(yù)期一致。用重組蛋... 

【文章來源】：南京師范大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：102 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
圖表清單
縮略詞表
第一章 干擾素的研究概況
    1 干擾素的分類及特征
    2 干擾素的分子結(jié)構(gòu)及特點
    3 干擾素的產(chǎn)生與作用特性
        3.1 干擾素受體
        3.2 干擾素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因調(diào)控
        3.3 干擾素誘生劑
    4 干擾素的生物學(xué)功能
        4.1 抗病毒活性
        4.2 抗腫瘤活性
        4.3 抗寄生蟲活性
        4.4 免疫調(diào)節(jié)活性
        4.5 免疫佐劑活性
第二章 禽類干擾素的研究進展
第三章 研究的目的和意義
第四章 揚州鵝IFN-α基因的克隆與生物信息學(xué)分析
    1 材料
        1.1 實驗動物
        1.2 表達載體與菌株
        1.3 儀器設(shè)備
        1.4 主要試劑及其配制
            1.4.1 培養(yǎng)基
            1.4.2 總RNA的提取與細胞培養(yǎng)所需試劑
            1.4.3 粗提質(zhì)粒試劑
            1.4.4 核酸電泳試劑
            1.4.5 感受態(tài)細胞制備試劑
    2 方法
        2.1 揚州鵝IFN-α基因的RT-PCR擴增
            2.1.1 引物設(shè)計與合成
            2.1.2 提取揚州鵝外周血總RNA
                2.1.2.1 提取經(jīng)刀豆素（ConA）誘導(dǎo)培養(yǎng)的鵝外周血淋巴細胞的總RNA
                2.1.2.2 提取未經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的鵝外周血淋巴細胞的總RNA
                2.1.2.3 提取鵝外周血淋巴細胞中總RNA
                2.1.2.4 提取鵝外周全血中的總RNA
            2.1.3 RT-PCR擴增揚州鵝IFN-α全長基因
                2.1.3.1 GoIFN-α基因的反轉(zhuǎn)錄（RT）
                2.1.3.2 GoIFN-α全長基因的PCR擴增
            2.1.4 擴增產(chǎn)物的純化
        2.2 揚州鵝IFN-α基因的T-載體克隆與鑒定
            2.2.1 IFN-α基因與pGEM-T easy的連接
            2.2.2 感受態(tài)細胞的制備及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
                2.2.2.1 DH5a感受態(tài)細飽的制備
                2.2.2.2 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞
            2.2.3 轉(zhuǎn)化菌落的篩選與鑒定
                2.2.3.1 陽性重組質(zhì)粒的篩選
                2.2.3.2 重組質(zhì)粒pGEM-T-GoIFN-α的鑒定
    3 結(jié)果
        3.1 揚州鵝IFN-α全基因的擴增
        3.2 克隆質(zhì)粒pGEM-T-GoIFN-α的鑒定
        3.3 揚州鵝IFN-α基因的生物信息學(xué)分析
            3.3.1 揚州鵝IFN-α核苷酸序列測序結(jié)果
            3.3.2 揚州鵝IFN-α氨基酸序列測序結(jié)果
            3.3.3 揚州鵝IFN-α同源性分析
            3.3.4 揚州鵝IFN-α進化樹分析
    4 討論
        4.1 RNA提取方法的分析
        4.2 揚州鵝IFN-α同源性等生物信息學(xué)分析
第五章 揚州鵝IFN-α基因的原核表達與高免血清的制備
    1 材料
        1.1 實驗動物
        1.2 表達載體與菌株
        1.3 儀器設(shè)備
        1.4 主要試劑及其配制
            1.4.1 培養(yǎng)基
            1.4.2 粗提質(zhì)粒試劑
            1.4.3 核酸電泳試劑
            1.4.4 感受態(tài)細胞制備試劑
            1.4.5 原核表達所需試劑
            1.4.6 蛋白質(zhì)電泳和Western Blotting所需試劑
            1.4.7 ELISA試劑
    2 方法
        2.1 揚州鵝IFN-α成熟肽基因的RT-PCR
            2.1.1 引物設(shè)計與合成
            2.1.2 RT-PCR擴增揚州鵝IFN-α成熟肽基因
                2.1.2. 1 GoIFN-α基因的反轉(zhuǎn)錄（RT）
                2.1.2.2 GoIFN-α成熟肽基因的PCR擴增
            2.1.3 擴增產(chǎn)物的純化
        2.2 載體pET32a（+）質(zhì)粒提取、酶切與回收純化
        2.3 揚州鵝IFN-α成熟肽基因的原核表達載體的構(gòu)建
            2.3.1 目的片段與pET32a（+）載體的連接
            2.3.2 感受態(tài)細胞的制備與連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.3.3 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定
                2.3.3.1 陽性重組質(zhì)粒的篩選
                2.3.3.2 重組質(zhì)粒pET32a-mGoIFN-α的鑒定
        2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達
            2.4.1 重組質(zhì)粒pET32a-mGoIFN-α轉(zhuǎn)化表達菌
            2.4.2 工程菌的誘導(dǎo)表達
            2.4.3 SDS-PAGE電泳
            2.4.4 表達條件的優(yōu)化
                2.4.4.1 誘導(dǎo)時間的摸索
                2.4.4.2 IPTG最佳濃度的摸索
            2.4.5 可溶性重組蛋白的制備及鑒定
                2.4.5.1 包涵體蛋白的純化與溶解
                2.4.5.2 重組蛋白的溶解、復(fù)性及鑒定
            2.4.6 目的蛋白的Western Blotting鑒定
        2.5 高免血清的制備
            2.5.1 重組蛋白抗原的制備
            2.5.2 免疫程序
            2.5.3 ELISA法檢測抗原免疫原性
            2.5.4 Western Blotting法檢測抗體特異性
    3 結(jié)果
        3.1 揚州鵝IFN-α成熟肽基因的擴增
        3.2 克隆質(zhì)粒pET32a-mGoIFN-α的鑒定
        3.3 重組蛋白的表達鑒定及條件優(yōu)化
            3.3.1 重組蛋白pET32a-mGoIFN-α的表達
            3.3.2 誘導(dǎo)時間的優(yōu)化
            3.3.3 IPTG最佳濃度的優(yōu)化
        3.4 揚州鵝IFN-α成熟蛋白的純化
        3.5 揚州鵝IFN-α成熟蛋白的Western Blotting鑒定
        3.6 揚州鵝IFN-α成熟蛋白多克隆抗體效價檢測
        3.7 鼠抗血清的Western Blotting檢測
    4 討論
        4.1 載體與宿主菌的選擇
        4.2 表達蛋白的純化
        4.3 揚州鵝IFN-α的免疫原性
第六章 揚州鵝IFN-α基因的真核表達及抗病毒活性檢測
    1 材料
        1.1 細胞與毒株
        1.2 表達載體
        1.3 儀器設(shè)備
        1.4 主要試劑及其配制
            1.4.1 培養(yǎng)基
            1.4.2 粗提質(zhì)粒試劑
            1.4.3 核酸電泳試劑
            1.4.4 感受態(tài)細胞制備試劑
            1.4.5 細胞培養(yǎng)試劑
    2 方法
        2.1 揚州鵝IFN-α真核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
            2.1.1 目的基因的制備
            2.1.2 載體pcDNA3.1（-）的準備
            2.1.3 目的片段與pcDNA3.1（-）載體的連接
            2.1.4 感受態(tài)細胞的制備與連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.1.5 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定
                2.1.5.1 陽性重組質(zhì)粒的篩選
                2.1.5.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-GoIFN-α的鑒定
        2.2 揚州鵝IFN-α重組蛋白在細胞中的表達
            2.2.1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-GoIFN-α轉(zhuǎn)染細胞
                2.2.1.1 提取重組pcDNA3.1-GoIFN-α的質(zhì)粒
                2.2.1.2 細胞的制備
                2.2.1.3 轉(zhuǎn)染細胞
            2.2.2 pcDNA3.1-GoIFN-α表達情況檢測
        2.3 揚州鵝重組pcDNA3.1-GoIFN-α抗VSV活性檢測
            2.3.1 鵝胚成纖維細胞的制備
            2.3.2 水皰性口炎病毒的擴增與保存
            2.3.3 VSV效價的測定
            2.3.4 重組揚州鵝IFN-a抗病毒活性測定
    3 結(jié)果
        3.1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-GoIFN-α的鑒定
        3.2 揚州鵝IFN-α基因在GEFs中的表達檢測
        3.3 揚州鵝IFN-α抗VSV病毒活性檢測
    4 討論
        4.1 揚州鵝IFN-α外源基因在鵝成纖維細胞中的表達
        4.2 干擾素的抗病毒活性檢測
結(jié)論
參考文獻
作者簡介
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3097630