乳腺上皮細胞是一種高度分化的體細胞，但其在體外培養(yǎng)條件下仍可保持合成和分泌乳汁的功能，因此可作為靶細胞被用于乳腺生物反應(yīng)器的制作，產(chǎn)生具有很高藥用價值和活性成分的外源蛋白質(zhì)產(chǎn)物，這對于建立乳腺生物反應(yīng)器、通過核移植獲得轉(zhuǎn)基因動物都具有重要的意義。因此建立一個有永生潛力乳腺上皮細胞系是非常重要的。相比于多種建立永生細胞系的方法，如過表達原癌基因、轉(zhuǎn)染SV40大T抗原等，使用端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因可有效降低細胞在永生化過程中發(fā)生生物學(xué)特征改變甚至發(fā)生癌變等的風(fēng)險。本實驗使用奶山羊的乳腺組織進行乳腺上皮細胞分離純化培養(yǎng)，向細胞內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染含有hTERT基因的表達載體，并進行細胞篩選，以期獲得永生化的山羊乳腺上皮細胞系，為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。獲得主要結(jié)果如下：1.使用組織塊培養(yǎng)法，在5d后組織塊遷出細胞，觀察細胞為多角形，形態(tài)一致，為典型乳腺上皮細胞的鋪路石狀，細胞界限清楚，連接緊密，分布密集，增殖旺盛，免疫組織化學(xué)鑒定表明乳腺上皮細胞表達角蛋白；通過體外誘導(dǎo)，山羊乳腺上皮細胞可以分泌β-酪蛋白。2.使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將外源基因pCI-neo-hTERT轉(zhuǎn)入第3代的奶山羊乳腺上皮細胞，經(jīng)500μg/... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

山羊乳腺上皮細胞角蛋白免疫熒光染色A:角蛋白染色；B：DAPI染色；C：合并圖D：白光圖

A BC D圖 2-2 山羊乳腺上皮細胞角蛋白免疫熒光染色A: 角蛋白染色； B：DAPI 染色；C：合并圖 D：白光圖Fig.2-2 cytokeratin immunofluorescence of GMECsA: cytokeratin staining; B: DAPI staining; C: Merge Figure D: White Figure

R 產(chǎn)物回收送測序，并將測序結(jié)果在 GeneBank 上和山羊 的全基因序列進行比對，GeneBank 上登錄號為 AF40909圖 2-4 RT-PCR 檢測 GMECs 的 β-酪蛋白的表達Fig.2-4 Detection of beta-casein expression in GMECs by RT-圖 2-5 GMECs 的 β-酪蛋白的 RT-PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果

【參考文獻】：
期刊論文
[1]表達hTERT及SV40T永生化奶牛乳腺上皮細胞系的建立[J]. 上官陶,王洪梅,馮敏燕,仲躋峰,何洪彬.  山東農(nóng)業(yè)科學(xué). 2013(02)
[2]荷斯坦奶牛乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)[J]. 厲世偉,谷靜娟,趙璐,李龍,王雪濤,況玲.  中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志. 2013(01)
[3]胰島素、催乳素和氫化可的松對奶牛乳腺上皮細胞增殖和凋亡的影響[J]. 田青,王洪榮.  中國飼料. 2013(02)
[4]奶山羊乳腺上皮細胞系的建立[J]. 佟慧麗,尹德云,李慶章,高學(xué)軍.  東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2008(08)
[5]小白鼠乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)變化[J]. 張以濤,李慶章.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2008(04)
[6]消化法培養(yǎng)山羊乳腺上皮細胞[J]. 富國文,武海軍,靳亞平.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2007(24)
[7]星形細胞膠質(zhì)瘤中生存素、周期蛋白E和端粒酶相關(guān)蛋白的表達與意義[J]. 王東林,施公勝,王艷芬,邵偉偉,黃華.  江蘇醫(yī)藥. 2007(07)
[8]催乳素及其受體對乳腺發(fā)育研究進展[J]. 苗培,楊國宇,惠永華.  畜牧獸醫(yī)雜志. 2007(01)
[9]牛乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)特性[J]. 多曙光,吳應(yīng)積,羅奮華,旭日干.  動物學(xué)研究. 2006(03)
[10]體外培養(yǎng)的牛乳腺上皮細胞形態(tài)研究[J]. 彭新榮,鄭月茂,張涌.  西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2005(01)

博士論文
[1]牛乳腺上皮細胞永生化及其多能性的研究[D]. 李吉霞.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2010

碩士論文
[1]奶牛乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)及應(yīng)用[D]. 王治國.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2007
[2]山羊乳腺上皮細胞的分離與體外培養(yǎng)[D]. 任芳麗.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2002
[3]山羊乳腺特異性表達載體的構(gòu)建與表達特性的研究[D]. 陳剛.揚州大學(xué) 2002



本文編號：3096520