牛支原體（Mycoplasma bovis）是牛的一種重要致病性支原體,可導(dǎo)致牛肺炎、乳房炎等一系列疾病。丙酮酸脫氫酶E1是生命體進(jìn)行糖酵解的關(guān)鍵酶,而目前牛支原體丙酮酸脫氫酶E1的生物學(xué)功能研究,以及其是否可以作為牛支原體病診斷靶標(biāo)的報(bào)道并不多見。本論文開展了牛支原體丙酮酸脫氫酶E1的克隆表達(dá)、單克隆抗體制備及其初步的生物學(xué)功能研究。本研究以PCR擴(kuò)增獲得pdhα和pdhβ基因,應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)pdhα和pdhβ基因序列進(jìn)行初步分析;構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-pdhα和pET-pdhβ,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白,應(yīng)用Western blot及ELISA對(duì)E1?亞基和E1β亞基在細(xì)胞內(nèi)的分布進(jìn)行了初步研究;重組融合蛋白rPDHA免疫小鼠制備免疫脾細(xì)胞,與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合,間接ELISA檢測(cè)能分泌預(yù)定抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞并進(jìn)行亞克隆篩選,同時(shí)對(duì)單克隆抗體的效價(jià)和反應(yīng)特異性進(jìn)行檢測(cè);利用帶有GFP標(biāo)簽的E.coli-pdhα-gfp、E.coli-pdhβ-gfp表達(dá)菌感染NBL-4細(xì)胞,置于熒光顯微鏡觀察黏附情況。結(jié)果顯示:①pdhα與pdhβ基因序列與其他已報(bào)道的相關(guān)序列具有... 

【文章來源】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Summary
外文縮略語表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 牛支原體及其致病機(jī)理和診斷研究進(jìn)展
        1.1 牛支原體
        1.2 牛支原體致病機(jī)理
        1.3 牛支原體相關(guān)疾病的診斷
            1.3.1 病原學(xué)診斷
            1.3.2 血清學(xué)診斷
            1.3.3 分子生物學(xué)診斷
    2 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體及其生物學(xué)功能
        2.1 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的結(jié)構(gòu)組成
        2.2 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的催化作用機(jī)理
        2.3 丙酮酸脫氫酶E1的結(jié)構(gòu)及功能特性
        2.4 丙酮酸脫氫酶在支原體的相關(guān)研究
    4 本研究的目的意義
第二章 牛支原體PDH E1亞基基因的克隆及相關(guān)信息分析
    1 材料
        1.1 菌種及載體
        1.2 儀器
        1.3 試劑
            1.3.1 主要試劑
            1.3.2 試劑配制
            1.3.3 培養(yǎng)基配制
    2 方法
        2.1 牛支原體基因組的粗提
        2.2 pdhα 和pdhβ 基因的擴(kuò)增及優(yōu)化
        2.3 目的基因序列相似性及抗原表位初步預(yù)測(cè)
    3 結(jié)果
        3.1 pdhα 和pdhβ 基因的擴(kuò)增及序列分析
        3.2 pdhα 和pdhβ 基因序列相似性分析結(jié)果
        3.3 E1α、E1β 亞基抗原表位初步預(yù)測(cè)結(jié)果
    4 討論
第三章 牛支原體PDH E1亞基基因原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位
    1 材料
        1.1 菌種、載體及試驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 儀器
        1.3 試劑
            1.3.1 主要試劑
            1.3.2 試劑配制
    2 方法
        2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析
        2.3 多克隆抗體的制備
        2.4 膜蛋白提取
        2.5 E1a、β 亞基在牛支原體細(xì)胞內(nèi)的分布
            2.5.1 Western-blot分析
            2.5.2 ELISA檢測(cè)
    3 結(jié)果
        3.1 原核表達(dá)質(zhì)粒p ET-pdhα、p ET-pdhβ 的酶切鑒定
        3.2 r PDHA及r PDHB的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.3 E1a、β 亞基在牛支原體細(xì)胞內(nèi)的分布
    4 討論
第四章 牛支原體丙酮酸脫氫酶E1α 亞基單克隆抗體的制備
    1 材料
        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、菌株、細(xì)胞及抗原
        1.2 儀器
        1.3 主要試劑
    2 方法
        2.1 BALB/c小鼠的免疫
        2.2 骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.3 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
        2.4 小鼠免疫脾細(xì)胞的制備
        2.5 確定最佳抗原包被量
        2.6 骨髓瘤細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞的融合
        2.7 雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測(cè)
        2.8 陽性雜交瘤細(xì)胞亞克隆篩選
        2.9 雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
        2.10 單克隆抗體效價(jià)檢測(cè)
        2.11 單克隆抗體特異性檢測(cè)
        2.12 雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定性檢測(cè)
    3 結(jié)果
        3.1 牛支原體抗原最佳包被濃度的確定
        3.2 細(xì)胞融合前小鼠尾血效價(jià)
        3.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立
        3.4 單克隆抗體的生物學(xué)活性
            3.4.1 單克隆抗體效價(jià)
            3.4.2 單克隆抗體特異性
        3.5 雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定性檢測(cè)
    4 討論
第五章 牛支原體丙酮酸脫氫酶E1亞基的黏附特性研究
    1 材料
        1.1 菌株、載體與細(xì)胞
        1.2 試劑
    2 方法
        2.1 熒光表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.3 E. coli-pdhα-gfp和E. coli-pdhβ-gfp對(duì)NBL-4 細(xì)胞的黏附試驗(yàn)
        2.4 E. coli-pdhα-gfp和E. coli-pdhβ-gfp對(duì)NBL-4 細(xì)胞的黏附抑制試驗(yàn)
    3 結(jié)果
        3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定
        3.2 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.3 E. coli-pdhα-gfp、E. coli-pdhβ-gfp對(duì)NBL-4 細(xì)胞的黏附試驗(yàn)
        3.4 多抗血清對(duì)E. coli-pdhα-gfp、E. coli-pdhβ-gfp的黏附抑制試驗(yàn)
    4 討論
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介
導(dǎo)師簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]山羊支原體山羊肺炎亞種單克隆抗體的制備及抗體結(jié)合抗原表位的篩選[J]. 鄭瑩瑩,駢亞亞,儲(chǔ)岳峰,趙萍,賀英,簡(jiǎn)瑩娜,姜永強(qiáng),逯忠新.  中國畜牧獸醫(yī). 2014(08)
[3]雞毒支原體丙酮酸脫氫酶E1β亞基單克隆抗體的制備和鑒定[J]. 張凡慶,譚磊,包世俊,任峰,陸鳳,費(fèi)榮梅,丁鏟.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2014(07)
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[5]綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae）丙酮酸脫氫酶E1-α亞單位基因（pdha）的克隆、表達(dá)及其免疫學(xué)活性測(cè)定[J]. 許健,儲(chǔ)岳峰,高鵬程,趙萍,賀英,剡根強(qiáng),逯忠新.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2012(03)
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[8]我國部分地區(qū)牛支原體肺炎和關(guān)節(jié)炎的病原體診斷[J]. 冉智光,謝建華,駱璐,楊澤林,凌洪權(quán),蘇承忠,熊仲良,范偉興,米自由.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2010(01)
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[10]牛支原體病研究進(jìn)展[J]. 胡長(zhǎng)敏,石磊,龔瑞,白智迪,郭愛珍.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2009(08)

博士論文
[1]滑液支原體膜表面丙酮酸脫羧酶的生物學(xué)特性研究[D]. 包世俊.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2014

碩士論文
[1]牛支原體p28基因的表達(dá)及間接ELISA方法的建立[D]. 劉洋.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2011



本文編號(hào)：3085048