發(fā)布時(shí)間：2021-03-10 05:57

　　為了研究rpoN基因?qū)S氏氣單胞菌致病性的影響,采用同源重組的方法構(gòu)建該基因缺失株。以該菌基因組DNA為模板,通過PCR擴(kuò)增rpoN基因的上、下游同源臂;以上、下游同源臂膠回收產(chǎn)物為模板,P1-1/P2-2為引物進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增相應(yīng)目的片段,從而獲得rpoN上下游同源臂連接片段;將獲取的連接片段連接pRE112,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取重組質(zhì)粒pRE112-rpoN,經(jīng)同源重組和抗生素篩選獲得維氏氣單胞菌rpoN基因缺失株ΔrpoN。同時(shí),依然利用重疊PCR將目的基因片段與啟動子相連接,而后與質(zhì)粒p BBR-MCS相連接,最后將重組質(zhì)粒pBBR-MCS-rpoN轉(zhuǎn)化至缺失株ΔrpoN中,構(gòu)建互補(bǔ)株C-rpoN。PCR鑒定和測序結(jié)果顯示,成功構(gòu)建出維氏氣單胞菌rpoN基因缺失株ΔrpoN和互補(bǔ)株C-rpoN。生物學(xué)特性分析試驗(yàn)結(jié)果表明rpoN的缺失導(dǎo)致維氏氣單胞菌TH0426菌落形態(tài)改變、生物被膜形成能力下降、動物致病性減弱,鞭毛斷裂,運(yùn)動性喪失。本研究中成功構(gòu)建了維氏氣單胞菌TH0426株rpoN基因的缺失株ΔrpoN,為進(jìn)一步研究維氏氣單胞菌減毒疫苗和rpo... 

【文章來源】：中國獸醫(yī)科學(xué). 2020,50(06)北大核心

【文章頁數(shù)】：10 頁

【部分圖文】：

rpoN基因缺失株的篩選與鑒定Figure1ScreeningandidentificationofrpoNgenedeletionstrainAB250bp100bp100bp

中國獸醫(yī)科學(xué)第50卷圖5維氏氣單胞菌TH0426野生株、缺失株及互補(bǔ)株的菌落形態(tài)Figure5ThecolonymorphologyofA.veroniiTH0426wild，mutantandcomplementarystrainsA：野生株TH0426；B：缺失株ΔrpoN；C：互補(bǔ)株C-rpoN。A：WildstrainTH0426；B：MutantstrainΔrpoN；C：ComplementarystrainC-rpoN.ABC2.2rpoN互補(bǔ)株的鑒定為驗(yàn)證互補(bǔ)株C-rpoN是否構(gòu)建成功，提取互補(bǔ)菌株C-rpoN的RNA（見圖3A），利用引物對P4-1／P4-2驗(yàn)證C-rpoN，檢測到912bp條帶，表明C-rpoN構(gòu)建成功。2.3rpoN生物學(xué)特性分析2.3.1PCR檢測以16SrRNA為內(nèi)參基因，檢測缺失株ΔrpoN和C-rpoN中rpoN基因的表達(dá)量，野生株為對照。結(jié)果顯示，從缺失株均未檢測到基因表達(dá)；互補(bǔ)株中rpoN基因的表達(dá)量為野生株的1.5倍（見圖4）。2.3.2菌落形態(tài)的觀察與生長曲線的繪制菌落形態(tài)的觀察結(jié)果（見圖5）顯示，野生株TH0426菌落呈圓形、邊緣整齊、表面光滑，但缺失株ΔrpoN的菌落形態(tài)呈明顯的波浪狀邊緣，互補(bǔ)株C-rpoN與野生株相比，無較大變化。生長曲線檢測結(jié)果顯示，缺失株ΔrpoN與野生株TH0426相比，生長速度并無明顯變化（見圖6）。2.3.3動物致病性的檢測2.3.3.1斑馬魚半數(shù)致死量的測定結(jié)果顯示，野生株TH0426對斑馬魚的LD50為（5.47±1.60）×102CFU／尾；缺失株ΔrpoN為（1.25±0.12）×104CFU／尾，缺失株ΔrpoN的LD50比野生株升高了22.9倍，毒力顯著下降（P＜0.001），互補(bǔ)株C-rpoN的毒力較圖2rpoN基因缺失株的RT-PCR驗(yàn)證Figure2RT-PCRverificationofrpoNgenedeletionstrainA：ΔrpoN和TH0426的RNA（1，2：缺失株ΔrpoN；3：野生株TH0426）；B：RT-PCR檢測結(jié)果（1，2：缺失株ΔrpoN；3：野生株TH0426）。A：ΔrpoNandTH0426RNA（1，2：Thedelet

┫允荊?吧?闠H0426菌落呈圓形、邊緣整齊、表面光滑，但缺失株ΔrpoN的菌落形態(tài)呈明顯的波浪狀邊緣，互補(bǔ)株C-rpoN與野生株相比，無較大變化。生長曲線檢測結(jié)果顯示，缺失株ΔrpoN與野生株TH0426相比，生長速度并無明顯變化（見圖6）。2.3.3動物致病性的檢測2.3.3.1斑馬魚半數(shù)致死量的測定結(jié)果顯示，野生株TH0426對斑馬魚的LD50為（5.47±1.60）×102CFU／尾；缺失株ΔrpoN為（1.25±0.12）×104CFU／尾，缺失株ΔrpoN的LD50比野生株升高了22.9倍，毒力顯著下降（P＜0.001），互補(bǔ)株C-rpoN的毒力較圖2rpoN基因缺失株的RT-PCR驗(yàn)證Figure2RT-PCRverificationofrpoNgenedeletionstrainA：ΔrpoN和TH0426的RNA（1，2：缺失株ΔrpoN；3：野生株TH0426）；B：RT-PCR檢測結(jié)果（1，2：缺失株ΔrpoN；3：野生株TH0426）。A：ΔrpoNandTH0426RNA（1，2：ThedeletionstrainΔrpoN；3：ThewildstrainTH0426）；B：RT-PCRdetectionresults（1，2：ThedeletionstrainΔrpoN；3：ThewildstrainTH0426）.123M123MAB5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp100bp5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp100bp圖3rpoN基因互補(bǔ)株的鑒定Figure3IdentificationofrpoNgenecomplementA：互補(bǔ)株rpoN的RNA（1：C-rpoN互補(bǔ)株；2：TH0426）；B：互補(bǔ)株rpoN內(nèi)側(cè)引物的PCR檢測（1：C-rpoN互補(bǔ)株；2：TH0426）。A：RNAofcomplementarystrainrpoN（1：C-rpoNcomplement；2：TH0426）；B：ComplementarystrainrpoNinnerprimerPCRdetection（1：C-rpoNcomplement；2：TH0426）.12M12MAB5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp100bp5000bp3000bp2000bp1500b

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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