犬新孢子蟲（Neospora caninum,N.caninum）是一種胞內(nèi)寄生性原蟲,屬于頂復(fù)門原蟲。新孢子蟲病呈全球性分布,給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,世界范圍內(nèi)針對新孢子蟲病尚無特效藥物或疫苗。新孢子蟲入侵宿主細(xì)胞是蟲體突破機(jī)體防線的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),其入侵過程主要為識別并黏附宿主細(xì)胞形成滑動連接體MJ侵入細(xì)胞后定殖。入侵過程取決于多種蛋白質(zhì)在寄生蟲和宿主細(xì)胞之間的相互作用,因此,研究新孢子蟲入侵機(jī)理有助于發(fā)現(xiàn)與入侵相關(guān)的基因和宿主靶標(biāo)。近年來的研究表明弓形蟲RON2/4/5/8與頂膜抗原-1（AMA1）組成的復(fù)合體是MJ的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),新孢子蟲頂膜抗原-1可與多種蛋白相互作用,但同RON2之間是否存在相互作用還尚未得到證實(shí)。因此本研究擬利用GST-Pull down和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)確定新孢子蟲AMA1與RON2之間是否存在相互作用,利用免疫熒光技術(shù)（IFA）對新孢子蟲AMA1與RON2進(jìn)行亞細(xì)胞定位,并進(jìn)行新孢子蟲AMA1與RON2蛋白對小鼠和山羊的免疫保護(hù)性研究,為新型抗新孢子蟲藥物及疫苗靶標(biāo)的開發(fā)提供參考。Nc AMA1與Nc RON2互作的GST-Pull down鑒定:GST-... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒雙酶切鑒定電泳圖

第二篇研究內(nèi)容第一章新孢子蟲NcAMA1與NcRON2相互作用的鑒定25圖1.2含His標(biāo)簽的pET-28a-NcAMA1載體蛋白表達(dá)與純化電泳圖（A）蛋白表達(dá)產(chǎn)物；（B）蛋白純化產(chǎn)物；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：菌體超聲上清液；2：純化的pET-28a-NcAMA1載體蛋白Fig1.2ExpressionandpurificationelectrophoresisofpET-28a-NcAMA1vectorproteinwithHistag（A）Proteinexpressionproduct；（B）Proteinpurificationproducts；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：Supernatantoftheexpressionproduct；2：PurifiedpET-28a-NcAMA1carrierprotein2.1.3含GST標(biāo)簽的pGEX-4T-NcRON2載體蛋白表達(dá)及純化將上述已經(jīng)成功構(gòu)建好并且已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)中的含GST標(biāo)簽的pGEX-4T-NcRON2載體用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)后得到的菌液進(jìn)行離心超聲儀超聲的得到的上清作為樣品，然后經(jīng)過蛋白電泳后發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)的大小約為33kDa，且表達(dá)的蛋白為可溶性蛋白（圖1.3A）；將蛋白進(jìn)行純化，再次進(jìn)行蛋白電泳可發(fā)現(xiàn)得到一個(gè)具有單一條帶的目的蛋白大小為33kDa且未發(fā)現(xiàn)有明顯的雜帶（圖1.3B），說明含GST標(biāo)簽的pGEX-4T-NcRON2載體蛋白純化效果較好，進(jìn)行后續(xù)步驟。

第二篇研究內(nèi)容第一章新孢子蟲NcAMA1與NcRON2相互作用的鑒定26圖1.3含GST標(biāo)簽的pGEX-4T-NcRON2載體蛋白表達(dá)與純化電泳圖（A）蛋白表達(dá)產(chǎn)物；（B）蛋白純化產(chǎn)物；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：菌體超聲上清液；2：純化的pGEX-4T-NcRON2載體蛋白Fig1.3ExpressionandpurificationelectrophoresisofpGEX-4T-NcRON2vectorproteinwithHistag（B）Proteinexpressionproduct；（B）Proteinpurificationproducts；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：Supernatantoftheexpressionproduct；2：PurifiedpGEX-4T-NcRON2carrierprotein2.1.4GST-Pulldown試驗(yàn)將純化后含GST標(biāo)簽的pGEX-4T-NcRON2載體蛋白和GST標(biāo)簽蛋白分別加入到GST蛋白純化填料中，使其孵育后結(jié)合，之后將含His標(biāo)簽的pET-28a-NcAMA1載體蛋白分別等量加入到前面處理后的GST蛋白純化填料中，完成GST-Pulldown試驗(yàn)。完成試驗(yàn)后使用WB試驗(yàn)對得到的洗脫液進(jìn)行分析。結(jié)果：pGEX-4T-NcRON2載體蛋白與pET-28a-NcAMA1載體蛋白共孵育得到的洗脫液中可以發(fā)現(xiàn)存在pET-28a-NcAMA1載體蛋白含His標(biāo)簽的條帶，GST標(biāo)簽蛋白與pET-28a-NcAMA1載體蛋白共孵育得到的洗脫液中沒有發(fā)現(xiàn)存在pET-28a-NcAMA1載體蛋白含His標(biāo)簽的條帶（圖1.4），證明了新孢子蟲NcAMA1


本文編號：3072175