隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)和科學(xué)研究的發(fā)展，多基因共表達(dá)技術(shù)在生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的作用越來越重要。目前，常用的多基因共表達(dá)方法有內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）元件載體、雙向或雙啟動(dòng)子共表達(dá)、多個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染及多病毒載體共感染等。但是這些方法都遇到了多基因共表達(dá)不平衡及表達(dá)量不足的問題，如IRES下游基因的表達(dá)對(duì)其在IRES之后的特異定位敏感，有可能造成表達(dá)沉默，或下游蛋白的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于同一開放閱讀框中上游蛋白的表達(dá)水平。2A肽則能夠改善以上缺陷。2A肽屬于cis-水解酶作用元件（CHYSELs），多基因載體在2A肽調(diào)控下各基因可獨(dú)立表達(dá)。與IRES相比，2A肽序列短（54-90bp）、能夠調(diào)節(jié)多基因獨(dú)立表達(dá)且表達(dá)效率高，具有其它多基因共表達(dá)技術(shù)無可比擬的優(yōu)點(diǎn)。目前，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備均以單基因表達(dá)為目標(biāo)，而多基因共表達(dá)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究較少。利用2A肽生產(chǎn)多基因修飾動(dòng)物已在小鼠和豬上報(bào)道，但在綿羊上未見報(bào)道。慢病毒載體轉(zhuǎn)基因技術(shù)是目前家畜生產(chǎn)中效率最高的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，2A肽介導(dǎo)的多基因共表達(dá)與慢病毒載體相結(jié)合制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，具有轉(zhuǎn)基因效率高、多基因同時(shí)表達(dá)的特點(diǎn)。在一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物上同時(shí)表達(dá)多個(gè)功... 

【文章來源】：石河子大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：125 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
英文摘要
中英文對(duì)照表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 2A肽在生物醫(yī)藥和生物技術(shù)中的研究進(jìn)展
        1.1 2A肽的起源
        1.2 常見的2A肽及類2A肽序列
        1.3 2A肽的作用機(jī)制
        1.4 2A肽介導(dǎo)的蛋白的亞細(xì)胞定位
        1.5 2A肽的作用效率
        1.6 2A肽的應(yīng)用
        1.7 多基因共表達(dá)構(gòu)建策略
        1.8 慢病毒多基因共表達(dá)載體
        1.9 前景
    2 DNA甲基化在動(dòng)物中的研究進(jìn)展
        2.1 DNA甲基化的表型特征
        2.2 DNA甲基化作用機(jī)制
        2.3 DNA甲基化調(diào)控信號(hào)
        2.4 DNA甲基化的分析方法
        2.5 DNA甲基化調(diào)節(jié)因子
        2.6 DNA甲基化抑制劑
        2.7 DNA甲基化與染色質(zhì)相關(guān)性
        2.8 組蛋白修飾
        2.9 組蛋白去乙酰化酶抑制劑
        2.10 甲基化在家畜中的研究現(xiàn)狀
第二章 三熒光基因共表達(dá)載體pLEX-2A-TYG的構(gòu)建及其在真核細(xì)胞中的表達(dá)
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 本實(shí)驗(yàn)使用的載體
        1.2 本實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞株
        1.3 本實(shí)驗(yàn)主要試劑
        1.4 本實(shí)驗(yàn)主要儀器
        1.5 主要試劑的配制
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 2A-linker的構(gòu)建
        2.2 引物的設(shè)計(jì)
        2.3 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）
        2.4 限制性酶酶切實(shí)驗(yàn)
        2.5 連接反應(yīng)
        2.6 克隆轉(zhuǎn)化
        2.7 陽性重組子的篩選鑒定9
        2.8 膠回收實(shí)驗(yàn)9
        2.9 細(xì)胞的培養(yǎng)10
        2.10 質(zhì)粒的提取
        2.11 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
        2.12 熒光顯微鏡檢測(cè)12
        2.13 Western blotting檢測(cè)
    3 結(jié)果
        3.1 2A肽-linker片段的獲取
        3.2 質(zhì)粒pacGFP1-N1的改造
        3.3 質(zhì)粒ptdtomato-2A和pzsYellow1-2A的獲得
        3.4 質(zhì)粒ptdTomato-acGFP1和質(zhì)粒pzsYellow1-acGFP1的獲得
        3.5 質(zhì)粒p2A-TYG的獲得
        3.6 質(zhì)粒pLEX-2A-TYG的獲得
        3.7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的熒光檢測(cè)
        3.8 Western blotting檢測(cè)結(jié)果
    4 討論
        4.1 Kozak consensus sequence
        4.2 2A肽介導(dǎo)的多基因載體在細(xì)胞中表達(dá)
        4.3 酶切位點(diǎn)的保護(hù)堿基
        4.4 多基因載體中三熒光蛋白基因的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果分析
第三章 慢病毒的包裝及滴毒檢測(cè)
    1 實(shí)驗(yàn)材料和方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株
        1.2 實(shí)驗(yàn)所用載體
        1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑
        1.4 主要試劑的配制
        1.5 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.2 重組質(zhì)粒的大量提取
        2.3 病毒的包裝
        2.4 慢病毒滴度的測(cè)定
        2.5 慢病毒的感染
        2.6 單克隆細(xì)胞的篩選
        2.7 激光共聚焦檢測(cè)
    3 結(jié)果
        3.1 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度檢測(cè)
        3.2 包裝病毒的滴度檢測(cè)
        3.3 單克隆細(xì)胞的篩選及檢測(cè)
    4 討論
        4.1 慢病毒載體特點(diǎn)
        4.2 慢病毒的包裝
        4.3 病毒的濃縮
        4.4 病毒滴度的測(cè)定
        4.5 提高病毒載體體外感染的能力
        4.6 實(shí)驗(yàn)室安全措施
第四章 轉(zhuǎn)基因羊的生產(chǎn)和檢測(cè)
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.3 主要試劑的配制
        1.4 主要儀器
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 轉(zhuǎn)基因羊的生產(chǎn)
        2.2 轉(zhuǎn)基因羊尾組織 DNA 的提取
        2.3 轉(zhuǎn)基因羊的 PCR 檢測(cè)
        2.4 Western blotting 檢測(cè)
        2.5 基因組 DNA Southern blotting
        2.6 RT-PCR 檢測(cè)
        2.7 DNA 甲基化分析
        2.8 CMV 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析
        2.9 統(tǒng)計(jì)分析
    3 結(jié)果
        3.1 三色熒光蛋白基因共表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)基因羊的生產(chǎn)情況
        3.2 轉(zhuǎn)基因羊的整合檢測(cè)結(jié)果
        3.3 轉(zhuǎn)基因羊甲基化分析
        3.4 CMV啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析結(jié)果 50
    4 討論
        4.1 慢病毒載體在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用
        4.2 2A肽在慢病毒介導(dǎo)的生物技術(shù)中的應(yīng)用
        4.3 轉(zhuǎn)基因羊DNA甲基化分析
        4.4 DNA甲基化檢測(cè)方法
        4.5 CMV啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)
第五章 轉(zhuǎn)基因羊內(nèi)外源基因 DN A 甲基化機(jī)制初步研究
    1 材料和方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.2 實(shí)驗(yàn)材料
        1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.4 主要試劑的配制
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 成纖維細(xì)胞的分離
        2.2 成纖維細(xì)胞的純化
        2.3 纖維細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.4 轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞的藥物處理實(shí)驗(yàn)
        2.5 熒光顯微鏡檢測(cè)
        2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)
        2.7 統(tǒng)計(jì)分析
    3 結(jié)果
        3.1 成纖維細(xì)胞的分離和純化
        3.2 TSA和5-azaC對(duì)成纖維細(xì)胞表觀狀態(tài)的影響
        3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果
    4 討論
        4.1 轉(zhuǎn)基因表達(dá)的影響因素
        4.2 DN A 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑-5-azaC
        4.3 去乙�；敢种苿� - TSA
        4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)
第六章 小結(jié)、創(chuàng)新點(diǎn)、展望
    1 小結(jié)
    2 創(chuàng)新點(diǎn)
    3 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
作者簡(jiǎn)介
致謝
導(dǎo)師評(píng)閱表


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Production of Transgenic Korean Native Cattle Expressing Enhanced Green Fluorescent Protein Using a FIV-Based Lentiviral Vector Injected into MII Oocytes[J]. Yong-Nan Xu,Sang-Jun Uhm,Bon-Chul Koo,Mo-Sun Kwon,Ji-Yeol Roh,Jung-Seok Yang,Hyun-Yong Choi,Young-Tae Heo,Xiang-Shun Cui,Joon-Ho Yoon,Dae-Hwan Ko,Teoan Kim,Nam-Hyung Kim.  遺傳學(xué)報(bào). 2013(01)
[2]DNA methylation and microRNAs in cancer[J]. Xiang-Quan Li,Yuan-Yuan Guo,Wei De,Department of Biochemistry and Molecular Biology,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,Jiangsu Province,China.  World Journal of Gastroenterology. 2012(09)
[3]“自我剪切”2A肽介導(dǎo)的Δ-12和ω-3脂肪酸脫氫酶以及過氧化氫酶在轉(zhuǎn)基因小鼠肌肉表達(dá)研究[J]. 方銳,彭云乾,鄭敏,孟慶勇.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2012(02)
[4]卵周隙內(nèi)注射慢病毒生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因綿羊的方法[J]. 汪立芹,劉晨曦,王靜,黃俊成.  中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào). 2011(01)
[5]嶗山奶山羊乳腺中孕激素受體基因甲基化與基因表達(dá)關(guān)系的研究[J]. 榮美潔,李蘭,董文娟,閔令江,潘慶杰.  青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2010(03)
[6]榮昌豬仔豬性別間DNA甲基化水平的差異研究[J]. 白小青,王金勇,陳英,潘紅梅,劉文,李軍峰.  中國畜牧雜志. 2010(13)
[7]綿羊Cdkn1c的DNA甲基化分析[J]. 趙麗霞,趙高平,郭榮啟,王丙萍,周歡敏.  中國畜牧獸醫(yī). 2010(04)
[8]牛4種組織中ZAR1基因表達(dá)及DNA甲基化修飾[J]. 辛鵬慧,岳永莉,李燕,于海泉.  畜牧與獸醫(yī). 2009(10)
[9]綿羊耳成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)[J]. 李桂芳,李巖,趙宗勝,李大全.  中國草食動(dòng)物. 2003(04)



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