豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）是豬流行性腹瀉病（porcine epidemic diarrhea, PED）的病原,屬于冠狀病毒科,為有囊膜,單股正鏈RNA病毒。該病是一種急性、高度接觸性的傳染病,以嚴(yán)重腸炎、嘔吐和水樣腹瀉為特征,對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2010-2012年,PED在免疫豬場(chǎng)的再次爆發(fā)說(shuō)明我國(guó)流行毒株可能發(fā)生了變異,導(dǎo)致疫苗免疫效果下降,因此對(duì)我國(guó)流行毒株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,比較疫苗株與野毒株之間的差異,有利于更具保護(hù)力的新型疫苗的開(kāi)發(fā)。首先,建立了PEDV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法并應(yīng)用于PEDV細(xì)胞培養(yǎng)物中病毒拷貝數(shù)的檢測(cè)。根據(jù)PEDV M基因保守序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物和探針,通過(guò)反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的優(yōu)化,成功建立了TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR （FQ-PCR）檢測(cè)方法,該方法具有特異、靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn),在101-109拷貝/u1之間具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99以上,擴(kuò)增效率在90%-110%之間。其次,本研究根據(jù)GenBank上登錄的PEDV參考株CV777（AF353511... 

【文章來(lái)源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：66 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
引言
上篇 豬流行性腹瀉研究進(jìn)展
    1 豬流行性腹瀉的歷史背景
    2 病原學(xué)
        2.1 病毒的形態(tài)
        2.2 分類地位
        2.3 理化特性
        2.4 細(xì)胞培養(yǎng)特性
        2.5 病毒基因組及其編碼蛋白
    3 流行病學(xué)
    4 診斷方法
        4.1 RT-PCR診斷方法
        4.2 免疫電鏡
        4.3 免疫熒光
        4.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
        4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
    5 PED的治療
    6 PED的預(yù)防
        6.1 PEDV滅活苗
        6.2 PEDV弱毒苗
    參考文獻(xiàn)
下篇 試驗(yàn)研究
    第一章 PEDV熒光定量檢測(cè)方法的建立及JS2008毒株在VERO細(xì)胞中的定量檢測(cè)
        摘要
        Abstract
        1 材料與方法
            1.1 菌株、毒株及病料
            1.2 主要試劑和儀器
            1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)及合成
            1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備
            1.5 FQ-PCR檢測(cè)方法的建立
        2 結(jié)果與分析
            2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備
            2.2 FQ-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
            2.3 FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
            2.4 FQ-PCR的敏感性分析
            2.5 FQ-PCR的重復(fù)性分析
            2.6 FQ-PCR的特異性分析
            2.7 細(xì)胞培養(yǎng)物中PEDV的定量檢測(cè)
        3 討論
        參考文獻(xiàn)
    第二章 PEDV全基因組測(cè)序及序列分析
        摘要
        Abstact
        1 材料與方法
            1.1 細(xì)胞和毒株
            1.2 樣品
            1.3 主要試劑
            1.4 主要儀器設(shè)備
            1.5 引物
            1.6 RNA的提取
            1.7 反轉(zhuǎn)錄
            1.8 PCR
            1.9 PCR產(chǎn)物鑒定及純化回收
            1.10 PCR產(chǎn)物連接與轉(zhuǎn)化
            1.11 重組質(zhì)粒提取、鑒定及序列測(cè)定
            1.12 全基因組序列確定、分析和比較
            1.13 參考序列
        2 結(jié)果
            2.1 JS2008、AH2012、JS-HZ2012和SX2012毒株的基因組結(jié)構(gòu)及分析
            2.2 S基因序列分析
            2.3 ORF3進(jìn)化分析
            2.4 E基因序列分析
            2.5 M基因序列分析
            2.6 N基因進(jìn)化分析
        3 討論
        參考文獻(xiàn)
全文結(jié)論
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒方法的建立與初步應(yīng)用[J]. 劉鄧,袁秀芳,冉多良,徐麗華,牛登元,王朝文,王一成.  中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào). 2010(01)
[2]豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎和豬輪狀病毒RT-PCR鑒別診斷技術(shù)研究[J]. 鄒勇,錢(qián)永清,唐永蘭,蘇萬(wàn)國(guó),何錫忠.  上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2003(02)
[3]豬流行性腹瀉病毒分子生物學(xué)特征[J]. 張強(qiáng)敏,郭福生,尹燕博,沈秋姑.  中國(guó)病毒學(xué). 2002(04)
[4]豬流行性腹瀉弱毒株的培育[J]. 佟有恩,馮力,李偉杰,王明,馬思奇.  中國(guó)畜禽傳染病. 1998(06)
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[8]使用細(xì)胞培養(yǎng)單層分離豬流行性腹瀉病毒[J]. 李樹(shù)根,李力施,霍燕瓊,李力復(fù),童昆周.  中國(guó)獸醫(yī)科技. 1991(10)
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