本文關(guān)鍵詞：豬3型腺病毒的分離與鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬3型腺病毒(PAdV-3)為嗜腸道型病毒,由于具有嚴格的宿主特異性,對豬無明顯的致病性,不需要額外的佐劑便可誘導較強的體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫,可用于大規(guī)模生產(chǎn),因此PAdV-3是理想的疫苗載體。目前,豬3型腺病毒和豬5型腺病毒都已獲得全序列,已被應(yīng)用于載體疫苗并取得較好效果。為獲得豬3型腺病毒用于載體疫苗研究,本論文采集健康豬腸內(nèi)容物通過ST細胞進行病毒分離培養(yǎng)并對分離毒株的關(guān)鍵基因p IX、hexon進行測序和分析,獲得如下結(jié)果:1.利用ST細胞連續(xù)傳代后,分離得到豬腺病毒毒株BJ14株(北京),Ben23、Ben29、Ben30、Ben33株(陜西)。2.對以上分離到的5株豬腺病毒hexon保守區(qū)序列(巢式PCR產(chǎn)物)、三株(Ben29、Ben30、Ben33)全長hexon基因及Ben30株的全長p IX基因進行進行擴增、克隆和測序。同時用DNAStar、Clone Manager將其與GeneBank中登錄的豬3型腺病毒毒株(IAF、6618、PAdV-3)的hexon、pIX序列進行序列變化、遺傳進化關(guān)系、抗原位點分析。(1)通過對五個毒株的巢式PCR產(chǎn)物的序列比對分析后發(fā)現(xiàn),本實驗室分離的五個毒株(Ben23、Ben29、Ben30、Ben33、BJ14)相互間的同源性在98.2%—99.7%之間。這5個毒株與與6618、IAF、PAV-3的同源性均在98.2%以上;與其他豬腺病毒的同源性在76%以下。(2)實驗室毒株Ben29、Ben30、Ben33 hexon基因核苷酸序列分析表明:Ben33、Ben29、Ben30的同源性達81.6%以上;Ben29、Ben30與IAF、6618的同源性達99.5%以上;Ben33與IAF、6618的同源性達81.2%以上。(3)通過抗原表位預測軟件預測發(fā)現(xiàn):實驗室毒株Ben29、Ben30、Ben33與6618毒株的hexon抗原優(yōu)勢表位相同,與PAdV-5的hexon抗原優(yōu)勢表位存在較大差異。(4)通過對實驗室毒株Ben30與6618毒株、IAF毒株、PAV-3毒株的pIX基因的序列比對分析發(fā)現(xiàn),Ben30的pIX的氨基酸與GenBank上公布的IAF毒株、6618毒株、經(jīng)典毒株相應(yīng)的片段比較,同源性達91%。綜合以上研究,本論文在國內(nèi)分離到豬3型腺病毒3株,研究結(jié)果可為進一步進行豬3型腺病毒感染性克隆的構(gòu)建以及對豬3型腺病毒進行分子生物學的研究奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬3型腺病毒 pIX hexon基因 遺傳進化分析
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-9
• 文獻綜述9-15
• 第一章 豬腺病毒的概述9-15
• 1.1 腺病毒的分子特征與基因組結(jié)構(gòu)特點9-11
• 1.1.1 腺病毒的分子特征9
• 1.1.2 腺病毒的基因組結(jié)構(gòu)9-11
• 1.1.2.1 E1基因9-10
• 1.1.2.2 E2基因10
• 1.1.2.3 E3基因10-11
• 1.1.2.4 E4基因11
• 1.1.2.5 ITR11
• 1.2 流行病學11-12
• 1.2.1 易感動物11-12
• 1.2.2 傳染源12
• 1.2.3 傳播途徑12
• 1.2.4 流行特點12
• 1.3 豬腺病毒的診斷12
• 1.3.1 血清學診斷12
• 1.3.2 分子生物學檢測12
• 1.4 豬腺病毒裁體的研究現(xiàn)狀12-15
• 1.4.1 豬3型腺病毒載體的構(gòu)建13
• 1.4.2 豬3型腺病毒作為表達載體的研究進展13-15
• 試驗研究15-33
• 第二章 豬3型腺病毒的分離與鑒定15-33
• 2.1 材料15-17
• 2.1.1 載體、細胞、菌株15
• 2.1.2 主要藥品及試劑15
• 2.1.3 溶液配制15-16
• 2.1.3.1 培養(yǎng)基及電泳相關(guān)溶液15-16
• 2.1.3.2 細胞培養(yǎng)基及相關(guān)溶液16
• 2.1.4 主要儀器16-17
• 2.2 方法17-20
• 2.2.1 病料的收集與處理17
• 2.2.2 PCR引物設(shè)計17
• 2.2.3 病毒DNA的提取17-18
• 2.2.4 巢式PCR檢測18
• 2.2.5 PAdV-3 病原分離18
• 2.2.6 分離毒株DNA的提取18
• 2.2.7 豬3型腺病毒hexon、pIX序列的擴增18-19
• 2.2.8 目的片段的獲得19
• 2.2.9 目的片段的連接19-20
• 2.2.10 轉(zhuǎn)化20
• 2.2.11 菌液PCR鑒定20
• 2.2.12 基因測序20
• 2.2.13 測序結(jié)果的處理與分析20
• 2.3 結(jié)果20-31
• 2.3.1 Nested-PCR檢測結(jié)果20-21
• 2.3.2 病原分離21
• 2.3.3 PCR擴增hexon、p IX基因21-22
• 2.3.4 重組質(zhì)粒的PCR鑒定22-23
• 2.3.5 巢式PCR擴增出的目的基因測序結(jié)果的分析23-28
• 2.3.5.1 分離毒株Ben23巢式PCR產(chǎn)物測序結(jié)果的分析23-24
• 2.3.5.2 分離毒株Ben29巢式PCR產(chǎn)物測序結(jié)果的分析24-25
• 2.3.5.3 分離毒株Ben30巢式PCR產(chǎn)物測序結(jié)果的分析25
• 2.3.5.4 分離毒株Ben33巢式PCR產(chǎn)物測序結(jié)果的分析25-26
• 2.3.5.5 分離毒株BJ14巢式PCR產(chǎn)物測序結(jié)果的分析26
• 2.3.5.6 巢式PCR產(chǎn)物遺傳變異分析26-28
• 2.3.6 hexon基因核苷酸序列分析及發(fā)育系統(tǒng)分析28-29
• 2.3.7 hexon基因的抗原性分析29-30
• 2.3.8 PCR擴增出的pIX基因測序結(jié)果分析30-31
• 2.4 討論31-32
• 2.5 小結(jié)32-33
• 結(jié)論33-34
• 參考文獻34-37
• 縮略詞表37-38
• 致謝38-39
• 作者簡介39

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