為了研究卡拉庫爾羊外周血淋巴細胞與TNF-α相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)、功能,本研究成功提取了卡拉庫爾羊外周血淋巴細胞總RNA并鑒定了 RNA的完整性,利用Smart cDNA文庫構(gòu)建試劑盒成功構(gòu)建了卡拉庫爾羊的外周血淋巴細胞cDNA文庫。用地高辛標(biāo)記的TNF-α探針從cDNA文庫中篩選與TNF-α相關(guān)的基因,并對篩選結(jié)果進行了分析。首先,采取健康卡羊的外周血,分離淋巴細胞,提取總RNA,鑒定總RNA的質(zhì)量和測定總RNA的濃度后,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈DNA后,用蛋白酶K和cDNA片段用C HROMA SPIN-400柱離心分離純化,與λTriplEx2 Vector載體連接后用包裝蛋白Gigapack III Go 1d Packing Extract對連接產(chǎn)物進行包裝,構(gòu)建cDNA文庫,測定初始文庫滴度和擴增文庫滴度。結(jié)果表明:正常卡拉庫爾羊外周血淋巴細胞cDNA文庫的原始庫容量為1.67×106pfu/ml,擴增文庫的滴度為3.3×109pfu/ml,實驗結(jié)果表明本實驗所構(gòu)建的cDNA文庫容量符合文庫構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)。其次,采用地高辛標(biāo)記試劑盒標(biāo)記了 TNF-α探針,并對探針的標(biāo)記效... 

【文章來源】：塔里木大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１卡拉庫爾羊外周血淋巴細胞分離圖譜（１：離心前；２：離心后）??Ｆｉｇ．ｌ?ｋａｒａｋｕｌ?ｓｈｅｅｐ?ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ?ｓｅｐａｒａｔｅ?（?１：?Ｐｒｉｏｒ?ｔｏ?ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ；?２：?Ａｆｔｅｒ?ｔｈｅ?ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）??

２．２．２新疆卡拉庫爾羊外周血淋巴細胞總ＲＮＡ的提取??從新疆卡拉庫爾卞外周Ｉｆｌｌ．淋巴細胞中提取得到總ＲＮＡ，用０．８?％瓊脂糖凝膠電泳對提取的總??ＲＮＡ進行完整性的鑒定（見圖２），圖中我們可以看到三條帶，從上到下依次是２８Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ?ＲＮＡ，??總ＲＮＡ沒有被污染，純度較高，質(zhì)景較好。??Ｍ?ｔ?２??ＨＢＫ！：：?—－：ｓ＊??５Ｉ＊??通＿＿＿＿＿＿?ｉ?ｉ?．??圖２卡拉庫爾羊淋巴細胞總ＲＮＡ基因電泳圖譜??Ｆｉｇ．２?ｋａｌａｋｕｌ?ｓｈｅｅｐ?ｔｏｔａｌ?ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ?ｒＲＮＡ?ｇｅｎｅ?ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐ－ｈｏｒｅｓｉｓ??Ｍ：?ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)（ＤＬ２０００）；泳道１，２：總ＲＮＡ基因??Ｍ：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）；?ｌａｎｅｓ?１，１：?ｒＲＮＡ?ｇｅｎｅ??２２??

２．２．４?ｃＤＮＡ第二鏈合成ＰＣＲ結(jié)果鑒定??ｍＲＮＡ經(jīng)第一鏈合成后再經(jīng)ＰＣＲ合成第二鏈，反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見??ｄｓＤＮ?Ａ形成彌散條帶在０．卜４ｋｂ之間。結(jié)采如圖３：??ＩＩ?１?１２??３０－Ｘｂｐ?—??２０００ｂ〇￣＾—?２０〇〇ｂｐ??ｌＯＯＣｂｐ—＾——ｌＯＯＯｂｐ??＾?７５０ｂｐ??＾?５００ｂｐ??＾?２５０ｂｔ＞??＾—ｌＯＯｂｐ??圖３卡拉庫爾羊淋巴細胞ｄｓＤＮＡ電泳圖譜??Ｍ１：?ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)（１Ｋｂ）?Ｍ２：?ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)（ＤＬ２０００）泳道１：?ｄｓＤＮＡ??Ｆｉｇ．３?ｋａｒａｋｕｌ?ｓｈｅｅｐ?ｔｏｔａｌ?ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ?ｄｓＤＮＡ?ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐ－ｈｏｒｅｓｉｓ??Ｍｌ：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ｌＫｂ）；?Ｍ２：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）；??ｌａｎｅｓ?１：?ｄｓＤＮＡ??２．２．５?ｄ）ＮＡ初始文庫的滴度測定??取初始文庫稀釋為ｌＯ＇ｌＯ—２，丨Ｏ—ＭＯ＂４各ＩｐＬ加ＺＯＯＨＬＸＬｉ－Ｂｌｕｅ?（ＯＤｓｏｏＨ．Ｏ）鈾板，４２Ｃ孵育過??夜后取出平皿，汁數(shù)噬菌斑的數(shù)最，１０“為１６７個，１０－２為１６個，１０－３為２個。用１０－１汁兌出初始文庫的??滴度為丨．６７ｘ?１?〇６個／ｍ丨

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]新疆卡拉庫爾羊TNF-α基因的克隆、原核表達及抗原性分析[D]. 賀艷艷.塔里木大學(xué) 2012
[2]新疆卡拉庫爾羊Fas基因的克隆、原核表達及抗原性分析[D]. 潘輝.塔里木大學(xué) 2012
[3]重組人腫瘤壞死因子（rhTNF-α）在大腸桿菌中的搖瓶表達、復(fù)性與同時純化[D]. 任文軒.西北大學(xué) 2009
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本文編號：3043556