本文關鍵詞：山東H9N2亞型禽流感病毒對α-2,6唾液酸受體親和性變化及血凝素蛋白糖基化對病毒致病性影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：禽流感(Avian influenza AI)是由A型流感病毒(Avian influenza virus type A)引起的一種傳染性疾病,根據致病性的強弱可以分為高致病性禽流感(HPAIV)和低致病性禽流感(LPAIV)。流感病毒基因由8個片段組成,其中血凝素蛋白(HA)和神經氨酸酶蛋白(NA)是病毒的主要囊膜糖蛋白。流感病毒感染宿主始于HA蛋白和宿主細胞上的受體結合,HA蛋白主要結合兩種形式唾液酸即:α-2,3唾液酸乳糖和α-2,6唾液酸乳糖。不同宿主的唾液酸的類型不同在一定程度上決定了流感病毒感染宿主的不同。迄今為止,已經發(fā)現(xiàn)H9N2亞型禽流感病毒不僅可以感染禽類,也可以可感染哺乳動物包括小鼠、豚鼠、雪貂、靈長類。血清學調查發(fā)現(xiàn)我國養(yǎng)殖從業(yè)人員血清中H9N2流感病毒抗體的陽性率達2.3%-13.7%,這表明H9N2亞型禽流感病毒已經獲得跨越種間屏障感染哺乳動物甚至是人的能力,因而具有引發(fā)新的流感大流行的潛在威脅。H9N2亞型AIV可以為新發(fā)流感病毒提供供體,如1997年香港流行的H5N1亞型流感病毒,其內部基因可能來源于A/Quail/Hong Kong/G1/97(H9N2)分離株。2013年流行的H7N9亞型AIV的內部基因有6個來自H9N2亞型AIV。因此,加強對H9N2亞型AIV對人源受體親和性變化的檢測以及病毒對哺乳動物致病機制研究具有重要的公共衛(wèi)生意義。本研究對2001-2013間分離的12株H9N2亞型禽流感病毒的HA基因進化分析發(fā)現(xiàn):12株AIV盡管都屬于Y-280這一大分支,但是又可以分為4個小的分支,這表明H9N2亞型禽流感病毒也在發(fā)生變異,盡管變異速度沒有H5亞型禽流感那么快速。固相結合試驗結果表明:不同的分離年代H9N2亞型AIV對α-2,6唾液酸受體的親和能力存在差異,總的趨勢是:隨著分離年代臨近,病毒對α-2,6唾液酸受體的親和能力逐漸增強,其中2013年分離株(A/Chicken/Shandong/903,簡稱CK/SD/903)對α-2,6唾液酸受體的親和性最強,2006年分離株(A/Chicken/Shandong/274,簡稱CK/SD/274)對α-2,6唾液酸受體的親和性最弱。通過對CK/SD/903和CK/SD/274這兩個模型毒株的HA蛋白糖基化位點進行比較發(fā)現(xiàn):CK/SD/903的血凝素蛋白分別在200和295位比CK/SD/274多了兩個N-糖基化位點,為了驗證這兩個位點糖基化是否影響病毒對α-2,6受體唾液酸受體親和性,我們構建了CK/SD/903的8質粒反向遺傳操作系統(tǒng),并且對CK/SD/903的血凝素蛋白的200和295位氨基酸進行突變,得到2個突變病毒。固相結合試驗結果表明HA N200Q(200位由N變?yōu)镼),而HA N295Q(295位由N變?yōu)镼)可以減弱病毒對α-2,6受體唾液酸受體親和性。為了進一步驗證這兩個位點的糖基化是否影響病毒對哺乳動物致病性,分別用106EID50的野毒和突變病毒(CK/SD/903(HA N200Q),CK/SD/903和CK/SD/903)攻毒6周齡小白鼠。攻毒試驗結果表明:HAN200Q(200位由N變?yōu)镼)后,盡管突變病毒對小鼠的體重沒有明顯影響,但是可以提高病毒在小白鼠腎臟等器官復制能力(病毒基因相對表達量是野毒的936.32倍);HA N295Q(295位由N變?yōu)镼)突變后,可以提高病毒在小白鼠肝臟等器官的復制能力(病毒基因相對表達量是野毒的56倍)。本研究系統(tǒng)的研究了2001-2013年間的12株H9N2亞型禽流感病毒HA基因進化和病毒對α-2,6唾液酸受體的親和性,結果表明:H9N2亞型流感禽流感病毒存在一定程度變異,盡管不如H5亞型流感那么明顯;隨著分離年代臨近,病毒對α-2,6唾液酸受體的親和性逐漸增強。利用反向遺傳操作技術驗證了903毒株HA蛋白200和295位糖基化影響病毒對α-2,6唾液酸受體的親和性變化,并且這兩個位點糖基化能夠影響病毒對小白鼠組織嗜性。這為闡明H9N2亞型流感病毒跨種間傳播的分子遺傳機制提供重要的理論和實驗依據,并且能夠為H9N2亞型流感病毒感染哺乳動物或者人提供預警,因此本研究具有重要的獸醫(yī)指導意義和公共衛(wèi)生意義。
【關鍵詞】：禽流感 受體親和性 糖基化位點 致病性
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 1 前言13-25
• 1.1 流感病毒的流行史13-15
• 1.2 流感病毒結構及感染宿主細胞的過程15-19
• 1.2.1 流感病毒的結構15-17
• 1.2.2 病毒粒子與宿主細胞受體的結合17-18
• 1.2.3 病毒粒子進入宿主細胞18
• 1.2.4 病毒核糖核蛋白（vRNP）的入核18
• 1.2.5 病毒基因組的轉錄和復制18-19
• 1.2.6 核糖核蛋白的出核19
• 1.2.7 病毒粒子的組裝和釋放19
• 1.3 流感病毒受體19-24
• 1.4 糖基化對病毒受體親和性和致病性的影響24
• 1.5 本研究的目的意義24-25
• 2 材料與方法25-39
• 2.1 試驗材料25-26
• 2.1.1 試驗毒株及載體25
• 2.1.2 試驗動物25
• 2.1.3 主要試劑25
• 2.1.4 試驗儀器25-26
• 2.1.5 主要試劑的配置26
• 2.2 試驗方法26-39
• 2.2.1 12株病毒HA基因的克隆測序及遺傳進化分析26-29
• 2.2.2 固相結合試驗分析禽流感病毒受體親和性的變化趨勢29-30
• 2.2.3 CK/SD/903反向遺傳操作系統(tǒng)的構建30-34
• 2.2.4 點突變質粒的構建與點突變病毒的拯救34-36
• 2.2.5 CK/SD/903和突變病毒生物學特性分析36-39
• 3 結果39-48
• 3.1 H9N2亞型禽流感病毒氨基酸序列分析39
• 3.2 H9N2亞型禽流感病毒遺傳進化分析39-41
• 3.3 固相結合試驗分析受體親和性變化趨勢41-42
• 3.4 CK/SD/903病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的構建42-44
• 3.5 點突變質粒的構建以及糖基化位點驗證44-45
• 3.5.1 點突變質粒構建及突變病毒的拯救44
• 3.5.2 SDS-PAGE驗證突變病毒和野毒糖基化位點44-45
• 3.6 突變病毒受體親和性變化及致病性試驗45-48
• 3.6.1 突變病毒受體親和性變化45-46
• 3.6.2 突變病毒對SPF胚和小白鼠的致病性46-47
• 3.6.3 利用熒光定量分析病毒在小白鼠內臟器官基因的相對表達量47-48
• 4 討論48-52
• 5 結論52-53
• 參考文獻53-60
• 致謝60-61
• 附錄61-62
• 攻讀碩士期間發(fā)表的文章62

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