本文關(guān)鍵詞：表達(dá)空腸彎曲菌保護(hù)性抗原cfrA、cjaA基因的重組乳酸菌的構(gòu)建及口服免疫研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)是彎曲菌屬的一種微需氧革蘭氏陰性菌,可在宿主腸道中定殖和感染引起多種疾病,如感染人引起腸炎和腹瀉,是人最重要的食源性病原菌之一�？刂萍仪輳澢奈廴臼墙档腿烁腥驹摼钪苯佑行У氖侄�,本研究擬結(jié)合特異性與非特異性免疫,將空腸彎曲菌保護(hù)性抗原基因?qū)胧称芳?jí)乳酸菌表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建表達(dá)保護(hù)性抗原的重組乳酸菌口服免疫制劑,達(dá)到降低雞腸道空腸彎曲菌定殖水平的目的。本研究首先將空腸彎曲菌腸菌素受體蛋白CfrA編碼基因?qū)胧称芳?jí)乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng),將構(gòu)建的重組乳酸乳球菌口服免疫雞,達(dá)到降低空腸彎曲菌在雞腸道中定殖的目的。利用PCR分別擴(kuò)增空腸彎曲菌CfrA全基因及其N端片段,插入食品級(jí)表達(dá)載體p NZ8149多克隆位點(diǎn)并轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ3900,通過Western blot鑒定重組菌株CfrA蛋白表達(dá)情況,篩選nisin濃度、溫度、時(shí)間等誘導(dǎo)條件優(yōu)化重組蛋白表達(dá)水平;將重組乳酸乳球菌經(jīng)口服免疫SPF雞,免疫后分別測定乳酸乳球菌自雞體內(nèi)的排出情況、誘導(dǎo)CfrA血清抗體和粘膜抗體水平,最后將空腸彎曲菌口服攻毒免疫后的雞,測定雞泄殖腔棉拭子中空腸彎曲菌的數(shù)目來判定口服免疫效果。Western blot檢測顯示CfrA全基因及其N端片段均可在重組乳酸乳球菌胞內(nèi)可溶性表達(dá),不能分泌至胞外,篩選的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為nisin濃度25 ng/m L、溫度37℃、時(shí)間1 h�？诜樗崛榍蚓�10 d內(nèi)自雞體完全排空;雞口服免疫后可產(chǎn)生CfrA蛋白特異性的血清IgG和腸粘膜sIgA抗體;重組乳酸乳球菌口服免疫后空腸彎曲菌在雞體內(nèi)的增殖速度顯著低于對照組。本研究成功構(gòu)建了重組CfrA蛋白的食品級(jí)乳酸乳球菌誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng);表達(dá)CfrA蛋白的重組乳酸乳球菌口服免疫雞對空腸彎曲菌在雞腸道的定殖具有一定的抑制作用。在空腸彎曲菌CfrA蛋白重組表達(dá)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建CjaA及CjaA-LTB蛋白重組乳酸乳球菌分泌性表達(dá)系統(tǒng)。利用PCR擴(kuò)增乳酸乳球菌-MG1363-未知分泌蛋白Usp45基因分泌信號(hào)肽的編碼序列SPusp45,克隆到食品級(jí)載體p NZ8149中,以空腸彎曲菌主要免疫保護(hù)性抗原CjaA蛋白的基因片段為靶基因,并插入大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位基因(LTB),構(gòu)建了表達(dá)空腸彎曲菌cjaA基因和融合表達(dá)cjaA-LTB的重組分泌性乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng),并對免疫效果進(jìn)行比較分析,Western blot檢測顯示cjaA基因可在重組乳酸乳球菌胞內(nèi)可溶性表達(dá),口服乳酸乳球菌7 d內(nèi)自雞體慢慢排空;雞口服免疫后可產(chǎn)生CjaA蛋白特異性的血清IgG和腸粘膜sIgA抗體;重組乳酸乳球菌口服免疫后空腸彎曲菌在雞體內(nèi)的增殖速度顯著低于對照組。結(jié)果成功構(gòu)建了重組CjaA蛋白的食品級(jí)分泌性乳酸乳球菌誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng);表達(dá)CjaA蛋白的重組乳酸乳球菌口服免疫雞對空腸彎曲菌在雞腸道的定殖具有一定的抑制作用。本研究成功構(gòu)建了表達(dá)空腸彎曲菌保護(hù)性抗原的食品級(jí)乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng),口服免疫雞可顯著降低空腸彎曲菌的定殖能力,為研制重組乳酸菌口服家禽免疫制劑防治空腸彎曲菌奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：空腸彎曲菌 乳酸乳球菌 腸菌素受體CfrA 膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CjaA 表達(dá) 口服免疫
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 中文摘要11-13
• Abstract13-15
• 1. 引言15-28
• 1.1 空腸彎曲菌研究現(xiàn)狀15-21
• 1.1.1 病原學(xué)15-16
• 1.1.2 流行病學(xué)16-18
• 1.1.3 毒力因子18-19
• 1.1.4 檢測空腸彎曲菌的方法19-21
• 1.2 乳酸菌及其表達(dá)系統(tǒng)的研究現(xiàn)狀21-25
• 1.2.1 乳酸菌的概述21-22
• 1.2.2 乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)22-23
• 1.2.3 食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)23-25
• 1.2.4 乳酸菌作為活疫苗抗原傳遞載體25
• 1.3 黏膜免疫的研究進(jìn)展25-27
• 1.3.1 黏膜免疫疫苗的研究25-26
• 1.3.2 大腸桿菌不耐熱毒素(LT)作為黏膜免疫佐劑的研究26-27
• 1.4 本研究的目的與意義27-28
• 2. 材料與方法28-53
• 2.1 材料28-31
• 2.1.1 菌種28
• 2.1.2 主要試劑與試劑盒28
• 2.1.3 主要儀器28
• 2.1.4 主要溶液及培養(yǎng)基的制備28-31
• 2.2 胞內(nèi)表達(dá)空腸彎曲菌cfrA基因重組乳酸乳球菌的構(gòu)建31-39
• 2.2.1 空腸彎曲菌cfrA基因重組乳酸乳球菌表達(dá)載體的構(gòu)建技術(shù)路線圖(見圖 2-1)31-32
• 2.2.2 乳酸乳球菌表達(dá)質(zhì)粒pNZ8149質(zhì)粒圖譜32
• 2.2.3 cfrA基因的PCR擴(kuò)增32-34
• 2.2.4 cfrA基因的克隆與鑒定34-37
• 2.2.5 表達(dá)cfrA基因重組乳酸乳球菌的構(gòu)建37-39
• 2.3 cfrA基因在重組乳酸乳球菌中的表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化39-41
• 2.3.1 重組乳酸乳球菌cfrA基因的誘導(dǎo)表達(dá)39
• 2.3.2 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot檢測分析39-40
• 2.3.3 重組乳酸乳球菌表達(dá)條件的優(yōu)化40-41
• 2.4 表達(dá)CfrA蛋白的重組乳酸乳球菌口服免疫研究41-42
• 2.4.1 口服免疫41
• 2.4.2 乳酸乳球菌自雞體內(nèi)排出的測定41
• 2.4.3 血清IgG和腸粘膜sIgA的測定41-42
• 2.4.4 攻毒保護(hù)試驗(yàn)42
• 2.5 表達(dá)空腸彎曲菌cjaA基因大腸桿菌重組表達(dá)載體的構(gòu)建42-45
• 2.5.1 cjaA基因的PCR擴(kuò)增42-43
• 2.5.2 cjaA基因的克隆與鑒定43-44
• 2.5.3 表達(dá)cjaA基因重組大腸桿菌的構(gòu)建44-45
• 2.6 cjaA基因在重組大腸桿菌中的表達(dá)與純化45-46
• 2.6.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)45
• 2.6.2 重組蛋白的純化45-46
• 2.7 分泌表達(dá)空腸彎曲菌cjaA與cjaA-ltb基因的重組乳酸乳球菌的構(gòu)建46-50
• 2.7.1 表達(dá)cjaA與cjaA-ltb基因重組分泌性乳酸乳球菌的構(gòu)建示意圖46-47
• 2.7.2 cjaA、SPusp45和ltb基因的PCR擴(kuò)增47-48
• 2.7.3 cjaA、SPusp45和ltb基因的克隆與鑒定48
• 2.7.4 分泌性重組表達(dá)載體的構(gòu)建48-49
• 2.7.5 表達(dá)cjaA基因重組分泌性乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建49-50
• 2.7.6 融合表達(dá)cjaA與ltb重組分泌性乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建50
• 2.8 cjaA與cjaA-ltb基因在重組分泌性乳酸乳球菌中的表達(dá)50-51
• 2.8.1 重組乳酸乳球菌的誘導(dǎo)表達(dá)50
• 2.8.2 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot檢測分析50-51
• 2.9 表達(dá)CjaA蛋白和融合表達(dá)CjaA與LTB重組分泌性乳酸乳球菌口服免疫研究51-53
• 2.9.1 口服免疫51
• 2.9.2 乳酸乳球菌自雞體內(nèi)排出的測定51-52
• 2.9.3 血清IgG和腸粘膜sIgA的測定52
• 2.9.4 攻毒保護(hù)試驗(yàn)52-53
• 3. 結(jié)果與分析53-68
• 3.1 胞內(nèi)表達(dá)空腸彎曲菌cfrA基因重組乳酸乳球菌的構(gòu)建53-55
• 3.1.1 cfrA基因的PCR擴(kuò)增53
• 3.1.2 cfrA基因的克隆與鑒定53-54
• 3.1.3 表達(dá)cfrA基因重組乳酸乳球菌的構(gòu)建54-55
• 3.2 cfrA基因在重組乳酸乳球菌中的表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化55-58
• 3.2.1 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot檢測分析55-56
• 3.2.2 重組乳酸乳球菌表達(dá)條件的優(yōu)化56-58
• 3.3 表達(dá)CfrA蛋白的重組乳酸乳球菌口服免疫研究58-60
• 3.3.1 重組乳酸乳球菌自雞體內(nèi)排出的測定結(jié)果58
• 3.3.2 血清IgG和腸粘膜sIgA抗體水平的測定結(jié)果58-59
• 3.3.3 空腸彎曲菌在雞腸道內(nèi)定殖的測定結(jié)果59-60
• 3.4 表達(dá)空腸彎曲菌cjaA基因大腸桿菌重組表達(dá)載體的構(gòu)建60-61
• 3.4.1 cjaA基因的PCR擴(kuò)增60
• 3.4.2 cjaA基因的克隆與鑒定60
• 3.4.3 大腸桿菌重組表達(dá)載體的構(gòu)建60-61
• 3.5 cjaA基因在重組大腸桿菌中的表達(dá)與純化61-62
• 3.6 分泌表達(dá)空腸彎曲菌cjaA與cjaA-ltb基因重組乳酸乳球菌的構(gòu)建62-63
• 3.6.1 SPusp45、cjaA和ltb基因的PCR擴(kuò)增62
• 3.6.2 SPusp45、cjaA和ltb基因的克隆與鑒定62-63
• 3.6.3 分泌性重組表達(dá)載體的構(gòu)建63
• 3.7 cjaA與cjaA-ltb基因在重組分泌性乳酸乳球菌中的表達(dá)63-66
• 3.7.1 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測分析63-64
• 3.7.2 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot檢測分析64-65
• 3.7.3 分泌表達(dá)的Western blot檢測分析65-66
• 3.8 表達(dá)CjaA蛋白的重組分泌性乳酸乳球菌口服免疫研究66-68
• 3.8.1 重組乳酸乳球菌自雞體內(nèi)排出的測定結(jié)果66
• 3.8.2 口服免疫后雞體重的變化66-67
• 3.8.3 血清IgG和腸粘膜sIgA抗體水平的測定結(jié)果67-68
• 3.8.4 空腸彎曲菌在雞腸道內(nèi)定殖的測定結(jié)果68
• 4. 討論68-72
• 5. 結(jié)論72-73
• 參考文獻(xiàn)73-78
• 致謝78-79
• 個(gè)人簡介79-80
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文80

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

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  本文關(guān)鍵詞：表達(dá)空腸彎曲菌保護(hù)性抗原cfrA、cjaA基因的重組乳酸菌的構(gòu)建及口服免疫研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：304252