近年來(lái)PPRV跨地區(qū)、跨國(guó)界的傳播,對(duì)全球防控PPR提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。開(kāi)展PPRV細(xì)胞受體的研究有助于探究PPRV的致病機(jī)理,對(duì)于該病的防控具有指導(dǎo)意義。與PPRV同屬的人的病毒麻疹病毒受體的相關(guān)研究已經(jīng)很深入,從文獻(xiàn)了解到人的麻疹病毒的受體分別為CD46、Slam、Nectin4這三種。目前,已經(jīng)證實(shí)PPRV與MV一樣利用SLAM作為受體開(kāi)啟病毒的入侵,本論文旨在闡明CD46分子是否也做為PPRV的受體,開(kāi)展了如下工作：1.采用3’/5’RACE方法從綿羊外周血淋巴細(xì)胞中首次克隆該基因,測(cè)序結(jié)果顯示綿羊CD46含有七種不同的可變剪切形式。構(gòu)建重組表達(dá)載體pCMV-Myc/CD46并在CHO-K1細(xì)胞中高效表達(dá),經(jīng)、Vestern blotting分析CD46蛋白表達(dá)良好,片段大小與預(yù)期符合。2.取編號(hào)CD46a基因進(jìn)行常規(guī)生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明,綿羊CD46a的cDNA序列開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1083bp,編碼由360個(gè)氨基酸殘基組成的多肽,該多肽分子質(zhì)量理論值為39ku,理論等電點(diǎn)為6.5。對(duì)該蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)綿羊CD46a第1-42位氨基酸殘基為信號(hào)肽序列共有5處N糖基化位點(diǎn),4處蛋白激... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

小反自獸疫病毒基因組結(jié)構(gòu)圖

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章綿羊CD46基因的克隆與表達(dá)收集該層細(xì)胞，沉淀經(jīng)反復(fù)洗2次即得所需淋巴細(xì)胞.然后加TRIzol試劑，按照TRIzoH?式劑盒說(shuō)明書(shū)抽提細(xì)胞總RNA。RNA提取過(guò)程中加入DNA酶消化處理，使用紫外分光光度計(jì)NanoDrop 2000測(cè)定RNA的A280和A260以計(jì)算總RNA的濃度，將其放入-80°C備用。2.2.2綿羊CD46基因的f廣增根據(jù)GenBank中收錄的綿羊CD46基因的兩條部分序列預(yù)測(cè)信息（XMJ)04013924.1，XM_004013923.1),與人的CD46進(jìn)行序列比對(duì)搜索到保守序列設(shè)計(jì)2條引物（分別命名為CD46UP,CD46DN),以提取的綿羊總RNA為模板擴(kuò)增該保守序列。獲得的序列經(jīng)NCBI Blast證實(shí)其為綿羊CD46部分序列。然后根據(jù)擴(kuò)增獲得的綿羊的CD46基因部分序列，設(shè)計(jì)5 'RACE和3’RACE需要的特異性引物GSP1和GSP2，巢式PCR鑒定引物NGSP1和NGSP2;將375’RACE片段及上述獲得的CD46部分序列拼接得到全長(zhǎng)基因，然后根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增綿羊CD46完整cDNA片段的引物CD46~cDNA-F和CD46~cDNA-R,引物設(shè)計(jì)策略如圖2.1所示，引物序列見(jiàn)表2.1。

擴(kuò)增片段均與己知CD46序列有重疊區(qū)域，經(jīng)blast和序列拼接分析得到全長(zhǎng)基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)lOg/L瓊脂糖凝膠電泳分析，條帶大小與預(yù)期擴(kuò)增片段基本一致，約為1500bp (見(jiàn)圖2.2)，經(jīng)測(cè)序證實(shí)為綿羊的CD46基因。M 1lOOObp 資露5 ■ +〒::. ■‘ 1750bp『^SOObp ‘ ‘ “ 1250bploobp r ’ ^ 4圖2.2綿羊CD46基因的RT-PCR丨廣增MDL2000Marker; 1 .PCR 產(chǎn)物。Fi^.2 RT-PCR amplification of CD46 gene of sheepMDL2000Marker; I. PCR product.2.3.2綿羊CD46基因序列分析pGEM-T easy載體的測(cè)序結(jié)果顯示，綿羊CD46基因存在七種可變剪切形式，將其命名為CD46a-g,使用ORF Finder找到CD46的7個(gè)剪切體的幵放閱讀框序列。2.3.3 pCMV/Myc/CD46a-g重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將CD46a-g擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI、Kpn I雙酶切后，與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，出現(xiàn)大小與目的片段相一致的特異條帶（見(jiàn)圖2.3)，說(shuō)明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。經(jīng)測(cè)序鑒定，CD46a-g七個(gè)不同剪切形式的ORF成功插入到表達(dá)載體pCMV/Myc中

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]表達(dá)小反芻獸疫H蛋白的重組山羊痘病毒疫苗[J]. 陳偉業(yè),曲林茂,胡森,胡倩倩,張倩,支海兵,黃克和,步志高.  生物工程學(xué)報(bào). 2009(04)
[2]我國(guó)西藏小反芻獸疫病毒China/Tib/Gej/07-30核衣殼蛋白基因和基因組啟動(dòng)子區(qū)的分子特征分析[J]. 包靜月,王志亮,李林,趙文姬,索朗次仁,李金明,王英麗,吳曉東,劉春菊,劉雨田,于小靜,楊詠梅.  病毒學(xué)報(bào). 2008(06)

博士論文
[1]小反芻獸疫病毒樣顆粒的裝配與釋放研究[D]. 王秋霞.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2013
[2]小反芻獸疫病毒全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建及DNA疫苗的免疫學(xué)研究[D]. 翟軍軍.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2012



本文編號(hào)：3041251